文献解读|Nat Med（50）：抗PD-1治疗后，与HIV病毒库相关的先天性抗病毒和免疫功能会减弱

抗逆转录病毒疗法（ART）改善了全球HIV感染者的死亡率和预后。ART可恢复CD4+ T细胞，使CD4:CD8 T细胞比例正常化，并促进免疫稳态。然而，ART并非治愈性疗法，中断治疗会导致血浆病毒载量迅速反弹。此外，HIV持续存在会驱动免疫激活和慢性炎症，并增加非艾滋病合并症（如癌症和心血管疾病）的风险。研究表明，即使长期接受ART治疗，潜伏的HIV仍存在于少量CD4+ T细胞中，这构成治愈的主要障碍。该HIV病毒库富含表达免疫检查点蛋白（PD-1、CTLA-4、TIGIT和TIM-3）的记忆性CD4+ T细胞；这些蛋白质的表达会损害维持储存库持久性的稳态增殖。ART可以抑制 HIV 病毒，但无法清除潜伏病毒库，该病毒库存在于表达程序性死亡蛋白 1 (PD-1) 的 CD4+T 细胞中。抗 PD-1 疗法已降低了 HIV 感染者 (PLWH) 合并癌症患者体内的 HIV 病毒库；然而，哪些患者能够从中获益以及病毒库降低的机制尚不明确。

为了阐明阻断PD-1结合所触发的导致潜伏性HIV病毒库减少的机制，研究团队分析了癌症免疫治疗试验网络-12（CITN-12；NCT02595866）试验期间收集的纵向样本。研究参与者的详细基线人口统计学和临床特征，包括年龄、性别、癌症类型和抗逆转录病毒治疗方案。该试验是一项多中心I期研究，其中对患有癌症的HIV感染者（PLWH）使用了抗PD-1抗体帕博利珠单抗（图1a）。本研究呈现的CITN-12免疫学分析是该临床试验预先设定的探索性部分，其检测方法和样本采集时间点均经过前瞻性定义，旨在捕捉抗PD-1给药后的免疫和病毒学动态变化。共有30名病毒载量受到抑制的HIV感染者（PLWH）接受了标准帕博利珠单抗方案治疗（每3周静脉注射200 mg，疗程最长2年），所有参与者均完成了至少两个疗程（图1a-b）。根据基线CD4+ T细胞计数，参与者分为三个队列：队列1（100-199个CD4+ T细胞/μL，n  =6）、队列2（200-350个CD4 + T细胞/μL，n  =12）和队列3（>350个CD4 +T细胞/μL，n  =12）（图1a-b）。这些参与者共患有11种不同的癌症，包括艾滋病相关癌症，例如卡波西肉瘤和非霍奇金淋巴瘤（图1a-b）。癌症亚型的分布与基于CD4+ T细胞计数的队列无显著相关性。值得注意的是，一名参与者达到完全缓解，四名参与者达到部分缓解（图1b）。他们从来自三个CD4+ T细胞计数队列的参与者中采集了样本，这些参与者患有11种不同的癌症类型，样本采集时间点分别为治疗前（C01D01）、治疗后24小时（C01D02）、治疗后1周（C01D08）和治疗结束时（EOT）。他们采用了一种综合的多组学方法。其中包括对血浆细胞因子和外周血单核细胞 (PBMC) 转录组进行分析，以确定治疗后 24 小时内与先前报道的潜伏 HIV（细胞相关 HIV DNA）下降和病毒再激活（HIV RNA）短暂增加相关的免疫改变。随后，他们研究了 (1) 这些转录组特征在治疗结束前的持续性，(2) 与 HIV 结局（例如，血浆 HIV RNA 和细胞相关 HIV DNA 水平）的关联，以及 (3) 使用单细胞和体外验证方法，研究它们在免疫细胞亚群中的普遍性和机制作用。

他们采用转录组分析(RNA-seq)来鉴定C01D01和C01D02之间发生改变的基因表达模块（图S1a-b）。为了获得这些模块，首先使用来自分子特征数据库（MSigDB）C7集合的免疫学特征基因集进行基因集富集分析（GSEA）。然后，基于前沿基因的重叠，将C01D02相对于C01D01显著改变的通路合并，并使用合并后的前沿基因来定义每个转录组模块。同时，使用GSEA评估了ChIP-X富集分析（ChEA）数据库中整理的转录因子靶标集的富集情况。该数据库汇总了来自多个染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和染色质免疫沉淀芯片（ChIP-chip）研究的经实验验证的转录因子-靶标相互作用。接下来，他们分析了样本水平的模块和转录因子靶标评分，以定量每位参与者32的这些基因集的相对表达量（图1c）。他们观察到，单核细胞功能（模块4和5）、IFN/病毒反应（模块2和3）以及CD8 T细胞活化（模块1）模块在C01D02时显著上调（图1c）。他们还观察到调节IFN反应（IRF、STAT1）、单核细胞效应功能（RELA、STAT4）和T细胞活化（STAT5）的转录因子增加，而免疫检查点阻断剂（如PDCD1、TIGIT、IL10RA）在C01D02时表达降低（图S1c-d）。在 C01D02 时，T 细胞干性、WNT/β-catenin 信号传导和调节性 T (Treg) 模块以及受 TCF1 和 β-catenin 调控的基因和表观遗传调控因子（如 EGR1和 EZH2）的表达均降低。

血浆细胞因子谱分析显示，在C01D02和C01D08时，包括IFNβ、IL-6和IFNγ（TH1反应）在内的固有免疫细胞因子显著上调，而TGFβ1水平在C01D02时显著降低。值得注意的是，TH 2（IL-4）和TH17（IL-17A）反应细胞因子的水平仅在C01D08时升高。接下来，他们构建了一个整合的转录组-细胞因子网络（图1d），以证明包含单核细胞功能、ISG和效应CD8+ T细胞相关基因集的转录组模块与血浆IFNγ、IL-6和IFNβ水平之间存在正相关性。相反，血浆TGFβ水平降低与WNT信号通路和Treg模块表达减少相关。这些结果表明，抗PD-1疗法可降低血浆TGFβ水平，并促进促炎和抗病毒先天免疫反应在24小时内快速增强。

上述抗PD-1诱导的转录组模块在14名HIV感染者（PLWH）的治疗结束时（EOT）保持稳定。然而，这些模块在EOT时将参与者分为两个不同的组（图1e）。第1组（ISGhi）（n  = 9）的样本表达ISG/抗病毒基因（模块2和3）、单核细胞基因（模块4和5）以及CD8效应基因（模块1）。纵向研究显示，第1组参与者在四个疗程（约3-4个月）内维持了较高的ISG水平和抗病毒模块的表达，表明免疫重编程持续存在。相比之下，第 2 组（ISGlo）PLWH（n  = 5），包括接受延长治疗（超过四个疗程）的患者，在治疗结束时表现出较低的 ISG 模块表达，表明这些免疫反应性的差异并非治疗持续时间所致。第 2 组样本还显示 WNT（模块 6）和 Treg 基因集（模块 7）的表达增加（图1e）。

在每个时间点对第1组和第2组参与者的样本进行直接比较（图2a）显示，在C01D01时，第1组的ISG（模块2和3）（图2b）和单核细胞（模块4和5）（图2c）表达显著高于第2组，而第2组的WNT信号通路（模块6）表达升高（图2d）。PD-1阻断后，两组的ISG和单核细胞模块均显著升高，而WNT信号通路/Treg模块则显著降低（图2b-d）。到治疗结束时，第1组的ISG和单核细胞模块表达仍然升高（图2b-c），并且效应CD8+ T细胞功能模块（模块1）显著升高（图2d），而该模块在基线时并未升高。相比之下，第 2 组受试者的 WNT 和 Treg 模块表达持续升高，而 ISG 和单核细胞反应减弱（图2b-c）。这些数据共同表明，第 1 组（ISGhi）和第 2 组（ISGlo）受试者之间的转录差异在基线时即可检测到，并在 PD-1 阻断后更加显著，其中一部分受试者表现出持久的 ISG 和髓系抗病毒模块表达——这凸显了持续的免疫重编程，而这可能是治疗反应的基础。

与先前的数据一致，C01D02时每百万细胞的HIV DNA拷贝数显著降低，而C01D08时血浆HIV RNA水平显著升高，且与血浆中高浓度的IFNγ和低浓度的IL-4相关（图2e）。他们还观察到，第1组的9名受试者中有8名在治疗结束时CD4 + T细胞中可诱导HIV RNA的频率降低，这与病毒库整体收缩一致。相比之下，第2组的5名受试者中有4名在治疗结束时可诱导HIV-1 RNA的频率升高（图2f）。值得注意的是，每百万细胞中的HIV DNA拷贝数与携带可诱导HIV的细胞频率呈正相关。虽然这两个参数也与其他病毒学标志物相关，但在血浆HIV RNA、未剪接HIV RNA或HIV RNA/HIV DNA比值方面未观察到显著的组间差异。值得注意的是，根据 CD4+ T 细胞计数、癌症类型或对治疗的临床反应，无法区分这两个组。这些结果表明，预先存在髓系 ISG 模块的 HIV 感染者亚群，在抗 PD-1 治疗的进一步诱导下，其 HIV DNA 水平也显著下降，这反映了 HIV 病毒库的减少。

接下来，他们利用单细胞转录组（scRNA-seq）技术分析了C01D01、C01D02和C01D08时点的免疫细胞亚群（图2g）。与C01D01相比，C01D02时单核细胞（尤其是经典单核细胞亚群）的频率显著增加，这一结果通过计算机模拟反卷积得到证实（图2h）。与此同时，自然杀伤细胞和CD8 T细胞的频率则有所下降（图2h）。对各亚群表达评分进行定量分析（图2i）显示，TLR模块在单核细胞中富集，IFN 模块在 T 细胞和髓系细胞中富集，Treg/ WNT 模块在淋巴细胞亚群中富集（图2i）。ISG 和抗病毒模块在TEMRA /TEM CD8 T 细胞、TH1/TH17/Treg CD4+ T 细胞和所有单核细胞亚群中均上调，其中IFNG转录本在效应 CD8+和 CD4+ THS1细胞中富集，而IFNB和IL6转录本在单核细胞中最高。为了鉴定第 1 组和第 2 组之间基于scRNA-seq的表达谱差异，他们分析了来自两组部分参与者在 C01D01、C01D02 和 C01D08 时单核细胞和 CD8 + T 细胞的模块表达。尽管样本量有限，但第 1 组（与第 2 组相比）的单核细胞在基线和抗 PD-1 治疗后 24 小时均表现出更高的 IFN 和 TLR 模块表达，而第 1 组的 CD8+ T 细胞在治疗后表现出更强的先天免疫和抗病毒模块诱导。这些结果表明，单核细胞中的早期抗病毒程序化先于效应 T 细胞反应，并且可能在治疗前就已存在。同时，他们将这些模块映射到来自健康个体、癌症患者或感染患者的35个公开的全血单细胞数据集，并观察到一部分个体，无论其疾病状态如何，均表现出ISG模块的高表达和Treg及WNT信号通路模块的低表达（图2j）。这些发现表明，高ISG和低Treg/WNT信号模块表达代表人类更广泛的免疫激活状态，与各种疾病和干预措施相关。

利用基于scRNA-seq的分析，他们鉴定了单核细胞的三个不同亚群，并定量分析了每个亚群中ISG和TLR模块的表达（图3a）。抗PD-1治疗后，未观察到亚群频率的显著变化。然而，与C01D01相比，他们观察到在ISGhi中，治疗后C01D02和C01D08时， IFIT2、B2M、CD86和CXCL10等基因的表达显著升高（图3b）。该ISGhi细胞群的TLR模块基因表达也降低（图3c）。相比之下，表达TLR模块的单核细胞亚群（聚类0和1）在PD-1治疗后未显示显著的转录变化（图3c）。他们使用NicheNet技术推断潜在的配体-受体相互作用，以鉴定ISGhi单核细胞表达基因上游的假定配体（图3d）。与血浆中IFNβ和IFNγ水平升高相一致（图3c），将IFNB1和IFNG鉴定为驱动ISGhi单核细胞中基因表达上调的关键上游细胞因子（图3d）。这些结果表明，阻断PD-1结合可显著增加单核细胞频率以及特定单核细胞亚群中抗病毒ISG的表达。

鉴定出四个CD8+ T细胞亚群（图4a），其中亚群1和3表现出较高的效应基因表达（表达GZMB、PRF1、IFNG和TNF）。与亚群1相比，亚群3在C01D01时ISG富集，并在C01D02时进一步诱导（图4b-c）。亚群3细胞的频率在C01D02时显著增加，而亚群1在C01D08时扩增（图4d）。细胞亚群注释显示，这两个亚群均包含效应细胞和TEMRA细胞群的混合，流式细胞证实了效应（CD27 - CD45RA+）CD8+ T细胞在C01D02时增加（图4e）。值得注意的是，聚类1和聚类3 都表现出 ISG 表达增加，这与效应细胞分化一致。

他们通过体外用 Gag 肽池刺激PBMC进行 HIV 特异性反应分析，结果显示，在 C01D02 时，Ki-67+、产生 IFNγ 的 CD8+ T 细胞的频率增加（图4f）。为了进一步表征这些反应，他们对流式细胞数据进行了无监督聚类分析，分析对象包括 HIV 特异性（IFNγ+和/或 TNF+）CD8+ T 细胞以及从未刺激和 Gag 刺激条件下随机抽取的总 CD8+ T 细胞。在所得聚类中，聚类8（富集于第 1 组）表现出高水平的 IFNγ、T-bet、Ki-67、Id2 和 Tox，并在 C01D08 时扩增。相比之下，第 2 组参与者在整个纵向随访期间均表现出 1 型簇的显著富集（虽然IFNγ 水平高，但 Ki-67、T-bet 和 Tox 表达降低）。在第 1 天第 1 天（C01D01），第 1 组中 12.87% 的 Gag 特异性 IFNγ+CD8+ T 细胞表达 Ki-67，而第 2 组仅为 3.01%。在第 1 天第 2 天（29.9% 对 15.5%）和第 8 天（54.1% 对 36.1%），该增殖亚群在第 1 组中扩增更为显著。这些结果表明，第 1 组 PLWH 体内存在预先存在的、对 PD-1 阻断疗法有反应的、具有功能的效应 CD8+ T 细胞。

为了鉴定效应CD8+ T细胞基因的上游配体，他们使用NicheNet分析，发现IFNβ1和IFNγ是ISG和效应基因（如TNF）的主要预测诱导因子（图4g）。同时，血浆TGFβ水平降低与效应CD8+ T细胞频率增加相关（图4h）；此外，还观察到参与静止期（ASXL1、BCL9L）和TGFβ信号通路（PEMPA1、SKIL）的基因表达下调（图4i）。综上所述，这些发现将抗病毒效应反应与病毒库减少联系起来，并提示PD-1阻断可快速诱导第1组参与者体内ISG+效应CD8+ T细胞的产生。

与在CD8+ T细胞中的发现类似，流式细胞技术和CIBERSORT分析PBMC数据均显示，在整个队列中，抗PD-1治疗后CD27+CD45RA−（中央记忆和过渡记忆）CD4+ T细胞亚群数量下降。CD4+ T细胞的注释鉴定出八个亚群，包括幼稚T细胞、Treg和效应T细胞。在治疗的第一周，效应模块（例如IL15RA和TNF）上调，而WNT信号通路下调。无偏亚聚类分析揭示了不同的细胞群：幼稚T细胞（聚类1）、ISGhi效应/记忆T细胞（聚类3）、ISGlo效应/记忆T细胞（聚类0）和调节性T细胞（聚类2）（图5a）。值得注意的是，簇3在第一周内保持稳定，而聚类0在同一时期显著下降（图5b-d），且与血浆HIV RNA水平升高相关（图5e）。使用HIV Gag肽库进行体外刺激的功能验证显示，除两名受试者外，所有受试者在治疗后24小时内HIV特异性IFNγ+ TNF+CD4+ T细胞的频率均增加（图5f）。此外，残余血浆病毒血症与HIV特异性CD4+T细胞的频率、血浆IFNγ水平以及效应模块和ISG模块的表达相关（图5f），提示存在针对HIV病毒库释放抗原的急性免疫反应。

为了鉴定基线（C01D01）时存在的以及在C01D02时动态诱导的分子特征和细胞因子，他们利用两个时间点的数据生成了加权特征评分（图6a）。该模型显示，较高的基线IFN诱导型、抗病毒和单核细胞TLR模块表达，结合C01D02时升高的IFNγ/IFNβ水平和降低的TGFβ水平，可预测治疗结束时较低的HIV DNA水平（图6a）。值得注意的是，基于这些加权特征预测的潜伏期HIV DNA水平与HIV DNA水平显著相关（图6b）。鉴于抗病毒和免疫调节ISG反应的重要作用，他们接下来对髓系细胞和T细胞群体中细胞亚群特异性的ISG表达谱进行了反卷积分析（图6c）。该分析揭示了两个细胞群中存在不同的ISG表达亚群。ISG +单核细胞上调了参与IFN/抗病毒信号通路（IRF7、IRF9、STAT1、BST2）、抗原呈递（B2M）和效应T细胞募集/分化（CXCL10、IL15）的基因。同时，ISG+ CD8+和ISG+CD4+ T细胞显示出髓系来源信号受体（IL15RA、TNF）和T辅助细胞极化介质（IL12RB1）表达升高。值得注意的是，这些ISG特征在HIV DNA水平较低的第1组参与者中显著富集，无论是在C01D01还是EOT（图6c）。

为了评估先天免疫刺激是否能增强抗病毒反应，他们用I/II型干扰素或TLR激动剂（poly I:C和R848）处理来自健康供体的记忆性CD4+ T细胞或去除CD8+ T细胞的PBMC。刺激导致CD4+ T细胞中抗病毒蛋白[即IFIT1（在接受抗PD-1治疗的1组HIV感染者中也升高）和APOBEC3G]的表达增加。在先天免疫细胞（例如单核细胞）存在的情况下，这种效应放大（图6d）。随后，在体外用HIV感染培养物，并添加或不添加干扰素拮抗剂。I/II型干扰素或TLR激动剂的刺激显著降低了HIV感染（图6e-f）。当存在先天免疫细胞时，TLR激动剂在抑制感染方面尤其有效。加入I型和II型干扰素拮抗剂后，尤其是在含有固有免疫细胞的培养物中，这种抗病毒控制作用消除。虽然两类干扰素均能提供抗病毒保护，但I型干扰素能更有效地诱导CD4+ T细胞中抗病毒蛋白的表达。

本研究对多名 HIV 感染者（合并癌症），在 CITN-12 I 期临床试验中进行了一项预先设定的探索性纵向多组学分析。该试验旨在评估帕博利珠单抗的安全性和初步抗肿瘤活性。该疗法总体耐受性良好，大多数不良事件为 1-2 级，5 名受试者观察到客观抗肿瘤反应（1 例完全缓解和 4 例部分缓解）。治疗后 24 小时内，本研究观察到 HIV 特异性效应 CD8+ T 细胞增殖增加，血浆 TGFβ 水平下降。此外，在追踪至治疗结束的14名参与者中（治疗开始后44至315天不等），有9名参与者表现出ISG、抗病毒限制因子和Toll样受体（TLR）信号通路的早期诱导和持续表达，以及HIV病毒库的减少。将这些转录组特征映射到1000多个公共多组学数据集上，结果显示抗PD-1诱导的程序存在于不同疾病状态的亚群中，表明部分人群已经表现出增强的抗病毒状态。总之，这些发现定义了有助于识别最有可能通过抗PD-1疗法实现病毒库衰减的HIV感染者的免疫通路，并提示持续的ISG激活可能有助于减少病毒库，并防止抗逆转录病毒疗法中断后病毒反弹。