文献解读|Signal Transduct Target Ther（81.2）：多组学揭示1型糖尿病患者年龄相关内型中微生物群、代谢物和免疫学异质性

1型糖尿病（T1D）是一种自身免疫性疾病，其特征是由于胰岛β细胞破坏导致胰岛素缺乏而引起的高血糖，其发生发展受遗传易感性和环境因素的双重影响。T1D是儿童期最常见的内分泌和代谢性疾病之一，发病高峰年龄为10-14岁，并造成严重的长期并发症和预期寿命缩短。越来越多的证据表明，T1D在临床特征、疾病进展速度、残余β细胞功能、免疫病理学和治疗反应等方面具有异质性，但其潜在的分子机制仍不甚明了。

为了系统地研究与儿童T1D诊断年龄相关的分子异质性，研究团队收集了108例新诊断T1D患者和56例年龄、性别匹配的健康对照者的血液、粪便和外周血单核细胞（PBMC）样本，并对肠道微生物组、血清代谢组、血清脂质组和PBMC单细胞转录组进行了整合分析。首先探讨了诊断年龄与临床参数之间的关联，将患者分为早发型（E-T1D，<7岁）、中发型（I-T1D，7-12岁）和晚发型（L-T1D，≥13岁）组。与健康对照组[HC，也分为早(E-HC)，中(I-HC)，晚(L-HC)对照]相比，T1D组中高危HLA基因型的频率升高，且在E-T1D、I-T1D和L-T1D亚组中呈下降趋势。各T1D亚组在诊断时的抗体阳性率和酮症发生率无显著差异。空腹C肽水平随年龄增长而升高，而血脂谱显示，L-T1D患者的代谢异常更为显著。HC的高密度脂蛋白胆固醇和总胆固醇水平未见统计学差异。T1D患者的甲状腺过氧化物酶抗体水平显著高于健康对照组，且L-T1D亚组的甲状腺过氧化物酶抗体水平有升高的趋势。偏最小二乘判别分析（PLS-DA）显示，E-T1D、I-T1D、L-T1D、E-HC、I-HC 和 L-HC 亚组的肠道菌群组成存在差异（图1a）。E-T1D、I-T1D 和 L-T1D 亚组之间以及 E-HC、I-HC 和 L-HC 亚组之间的 β 多样性存在显著差异（图1b-d）。I-T1D 似乎处于过渡状态，与 E-T1D 和 L-T1D 部分重叠。相对丰度分析进一步阐明了 T1D 各亚组之间的组成差异（图1e）。

通过线性判别分析效应量（Lefse）（图S1a-b）鉴定了E-T1D、I-T1D和L-T1D亚组之间的差异性微生物群。为了消除年龄对T1D亚组间微生物群特征的潜在混杂影响，还鉴定了E-HC、I-HC和L-HC亚组之间的差异性微生物群（图S1c）。随后，将每个T1D亚组的差异性微生物群减去相应HC亚组的差异性微生物群，以确定每个T1D亚组的特定微生物特征（图1f）。最后，Lefse分析结果显示，在E-T1D、I-T1D和L-T1D亚组中，Acetatifactor属、厚壁菌门A（Firmicutes A）和拟杆菌科（Bacteroidaceae）分别是富集程度最高的微生物特征。他们还在不同的分类水平上鉴定了T1D亚组中特有的微生物特征。对三个T1D亚组的粪便微生物组进行了KEGG通路功能富集分析，戊糖和葡萄糖醛酸相互转化通路以及苯丙氨酸代谢通路在E-T1D亚组中的报告基因得分最高（图1g）。

他们利用非靶向液相色谱-串联质谱法鉴定了3882种血浆代谢物，并手动将其注释为1096种内源性代谢物和2786种环境代谢物。PLS-DA分析结果表明，E-T1D、I-T1D、L-T1D、E-HC、I-HC和L-HC亚组的血清代谢物谱存在显著差异，无论是在所有代谢物、内源性代谢物还是环境代谢物方面均如此。I-T1D位于E-T1D和L-T1D之间，与两者部分重叠，提示其可能是一种中间代谢表型（图2a-f）。

基于正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）的VIP值以及单变量分析的差异倍数（FC）和q值，筛选差异代谢物，并按内源性和环境来源进行分类（图2g）。为了消除年龄对T1D各亚组代谢谱的潜在混杂效应，他们还鉴定了E-HC、I-HC和L-HC亚组间的差异代谢物。对于每个亚组，将与其他两个亚组进行两两比较时水平显著升高的代谢物定义为该亚组的特征代谢物，并减去相应年龄匹配的HC亚组的结果，从而获得亚组特异性代谢特征。在 E-T1D、I-T1D 和 L-T1D 亚组中鉴定出亚组特异性代谢物，分别包含 26、25 和 19 种内源性代谢物，以及 30、33 和 65 种环境代谢物（图2h-i）。在内源性代谢物中，哌啶酸在 E-T1D 中增幅最大，睾酮在 I-T1D 中增幅最大，N-乙酰高瓜氨酸在 L-T1D 亚组中增幅最大（图2j）。在环境代谢物中，5.929_467.12005（N-[2-(4-甲氧基苯氧基)-5-(三氟甲基)苯基]-5-甲基-2-苯基-1,3-噁唑-4-甲酰胺）在E-T1D亚组中表现出最显著的变化，在I-T1D组中也显著升高。而在L-T1D亚组中，HMDB0256007（Hypromellosum）的升高幅度最大（图2k）。此外，通过对内源性代谢物进行功能通路富集分析，发现醚脂代谢是E-T1D亚组中富集程度最高的通路，而生物素代谢在L-T1D亚组中富集程度最高。对于在T1D各亚组中宏基因组富集的KEGG功能通路，他们分析了代谢组中各通路内代谢物的分布情况。在E-T1D组中上调的戊糖和葡萄糖醛酸相互转化通路中，木糖酸在E-T1D组中显著上调。在 L-T1D 中上调的苯丙氨酸代谢通路中，苯乙醛、l-5-羟色氨酸和 3-苯乳酸在 L-T1D 中表现出显著上调。

PLS-DA分析显示，六个亚组的血清脂质谱也存在差异。与代谢组学数据一致，I-T1D组的脂质组学模式介于E-T1D组和L-T1D组之间（图3a-c），各亚组间显著升高或降低的脂质数量（图3d）。为了排除年龄对脂质组成的影响，他们还分析了E-HC、I-HC和L-HC亚组之间的脂质组学差异。在每个T1D亚组中，与另外两个亚组相比显著升高的脂质视为该亚组的代表性脂质。然后，他们以年龄匹配的健HC的结果作为参考，以去除共同的改变，并确定每个T1D亚组特有的脂质特征。在E-T1D组中共鉴定出15种脂质组学特征，在I-T1D组中鉴定出23种，在L-T1D组中鉴定出13种（图3e）。各组中变化最显著的脂质分别是：E-T1D组的LPA(16:1)，I-T1D组的TG(16:0/18:2/18:3)，以及L-T1D组的TG(18:0/18:1/18:1)（图3f）。

他们还比较了每个T1D亚组与其相应的健康对照组，以识别差异表达的脂质。结果显示，与E-HC亚组相比，E-T1D亚组中有51种脂质表达上调，40种脂质表达下调。与I-HC亚组相比，I-T1D亚组中有84种脂质表达上调，63种脂质表达下调，其中富集最显著的通路是不饱和脂肪酸生物合成通路。与L-HC亚组相比，L-T1D亚组中有2种脂质表达上调，1种脂质表达下调。

他们从包含微生物组、代谢组和脂质组数据的样本中，根据诊断年龄选择了10例早期1型糖尿病（E-T1D）、10例I-T1D和7例L-T1D患者，并分别匹配了10例E-HC、10例I-HC和7例L-HC，这些对照组的年龄和性别与上述患者相匹配。总共对54个样本进行了的单细胞转录组分析(scRNA-seq)，获得了包含376996个细胞中32177个基因的转录谱。他们鉴定了 13 种免疫细胞类型：CD14+经典单核细胞 (cM)、CD16+非经典单核细胞 (ncM)、常规树突状细胞 (cDC)、浆细胞样树突状细胞 (pDC)、CD4+ T 细胞 (CD4T)、CD8+ T 细胞 (CD8T)、黏膜相关不变 T 细胞 (MAIT)、γδ T 细胞 (γδ T)、自然杀伤细胞 (NK)、增殖性 T/NK 细胞 (Prolif)、B 细胞 (B)、浆母细胞和祖细胞（图4a-c）。PLS-DA 分析与先前描述的组学数据高度一致，揭示了 E-T1D、I-T1D、L-T1D、E-HC、I-HC 和 L-HC 之间存在明显的组间差异和组内连续性（图4b，图S11a-b）。

他们使用加权最小二乘法计算每个样本中的免疫细胞比例，以鉴定参与从 E-T1D、I-T1D 到 L-T1D 转录组转变的关键免疫细胞。B 细胞和浆细胞在 E-T1D 中占总淋巴细胞的比例最高，在 L-T1D 中最低，在 I-T1D 中居中。相反，MAIT细胞在T1D组和HC组中均呈现相反的趋势（图4d，图S11c）。在包含15名受试者的独立队列中，他们验证了三个T1D亚组中B细胞和MAIT细胞比例的这些趋势（图4e）。由于外周血中浆细胞数量较少，他们重点关注B细胞和MAIT细胞进行功能分析。对E-HC、I-HC和L-HC亚组进行相同的分析，以识别与年龄相关的转录差异。然后，通过去除在相应HC亚组中也上调的基因，对每个T1D亚组中的DEG进行精简，以排除年龄相关效应。DEG重叠分析表明，E-T1D和I-T1D在B细胞和MAIT细胞中均具有最多的重叠DEG，而L-T1D的重叠较少（图S11d）。功能通路富集分析揭示了T1D亚组中B细胞和MAIT细胞存在不同的通路。在两种细胞类型中，E-T1D 更富集免疫相关通路，例如 B 细胞中的 NF-κB 激活，以及 MAIT 细胞中的干扰素反应和白细胞介素-15 信号通路；而 L-T1D 则富集氨基酸代谢通路，例如 B 细胞中的蛋白质生成氨基酸和 MAIT 细胞中的丝氨酸家族氨基酸。I-T1D 则兼具两个亚组的特征，富集免疫和代谢相关通路（图4f）。

为了分析T1D各组中B细胞的异质性，他们将41,675个B细胞（包括浆母细胞）重新聚类为四个亚群：幼稚B细胞（B_Naive）、记忆B细胞（B_Mem）、非典型B细胞（B_Atypical）和浆母细胞（Plasmablast）（图S11e）。B_Naive细胞在E-T1D组中最为丰富，在L-T1D组中最少，在I-T1D组中居中。B_Mem和B_Atypical细胞的趋势相似，但差异不显著（图S11f）。由于 B_Atypical 细胞数量较少，且归类为记忆 B 细胞的一个亚群，他们将 B_Mem 和 B_Atypical 细胞合并为一个单一细胞群（B_Mem_Atypical）。对 B_Naive 和 B_Mem_Atypical 细胞的差异表达基因（DEG）重叠分析显示，E-T1D和I-T1D之间存在显著的重叠（图S11g）。B_Naive 和 B_Mem_Atypical 细胞的通路富集分析证实，E-T1D 主要富集于免疫相关通路，包括抗原呈递、炎症反应和 TCR 信号传导。晚期 1 型糖尿病（L-T1D）则富集于代谢通路，特别是涉及蛋白质和氨基酸代谢的通路。I-T1D 反映了免疫和代谢过程的混合，与其过渡表型相符（图S11h）。

为了鉴定微生物群与宿主免疫状态之间的直接相互作用，以及代谢物或脂质介导的间接相互作用，他们构建了基于T1D亚组在不同组学水平上上调的生物标志物的大规模多组学相互作用网络，其中包括65个微生物分类群、94个内源性代谢物、184个环境代谢物、53个脂质以及724个源自外周血B细胞转录组谱的基因，这些基因均已进行功能注释，与细胞增殖、炎症反应和代谢信号传导相关。他们分别构建了内源性和环境代谢物的多组学网络。为了降低高度相关的代谢物或脂质之间的冗余和多重共线性，采用绝对相关系数≥0.9的保守阈值进行成对相关性过滤。仅保留每个高度相关聚类中最具代表性的代谢特征用于后续的相关性分析和网络推断。共鉴定出175个微生物群-代谢物/脂质相互作用对，其中87个来自内源性代谢物和脂质，88个来自环境代谢物。此外，还检测到3836个代谢物/脂质-基因相互作用对，包括1878个来自内源性代谢物和脂质的相互作用对和1958个来自环境代谢物的相互作用对，以及766个微生物群-基因相互作用对。这些相互作用共构成665个直接的微生物群-基因相互作用和2608个显著的微生物群-代谢物/脂质-基因三元相互作用，其中1293个来自内源性代谢物和脂质，1315个来自环境代谢物（图5a-b）。

在所有鉴定到物种水平的微生物群分类单元中，Dialister invisus与其他微生物群的关联性最强，且与数量最多的基因（n  = 26）存在显著相关性。其中，Dialister invisus与ROCK2、STMN1和ALG11的相关性可能由代谢物介导，且与STMN1的相关性最强。Dialister invisus在E-T1D亚组中特异性上调，且与诊断年龄呈负相关，仅与内源性代谢物DG(12:0/12:0/0:0) [iso2]和二十二碳五烯酸（DPA）存在显著相关性。Dialister invisus参与了18个涉及这两种代谢物的三元相互作用，包括Dialister invisus-DPA- STMN1三元相互作用。DPA在E-T1D亚组中也呈上调，且与诊断年龄呈负相关。虽然DPA并非1型糖尿病特异性生物标志物，且在E-HC亚组中的表达也高于其他两个HC亚组，但其在1型糖尿病组中的丰度显著高于HC组。为了验证DPA对外周免疫环境的影响，他们用不同浓度的DPA在体外刺激从PBMC中分离的B细胞（图5c）。在高浓度DPA刺激（1 mM、2 mM）下，B细胞增殖并上调STMN1基因的表达，STMN1是细胞增殖和分化的调节因子（图5d-e）。与这些结果一致，转录组分析也显示，STMN1在E-T1D亚组中的表达最高（图5f）。体外实验结果与多组学相互作用网络和外周转录组分析结果一致，均显示DPA丰度与B细胞中STMN1基因表达呈显著正相关，且E-T1D组外周血B细胞比例最高。此外，DPA刺激后培养上清液中白细胞介素-6（IL-6）和IgM的浓度显著升高，表明B细胞活化增强，抗体分泌增加。

本研究整合了108例新诊断的儿童T1D患者和56例健康对照者的微生物组、代谢组、脂质组和单细胞转录组数据，以探讨与年龄相关的内型，多组学分析揭示了不同T1D亚组之间存在独特的分子特征。微生物特征最显著的分别是：E-T1D 中的Acetatifactor属、I-T1D 中的Firmicutes A门以及 L-T1D 中的Bacteroidaceae科。代谢物方面，哌啶酸在 E-T1D 中升高最为显著，睾酮在 I-T1D 中升高最为显著，而N-乙酰高瓜氨酸在 L-T1D 中富集最为显著。脂质组学分析揭示了亚组特异性改变，E-T1D 中 LPA(16:1) 水平升高，I-T1D 中 TG(16:0/18:2/18:3) 水平升高，L-T1D 中 TG(18:0/18:1/18:1) 水平升高。外周血B细胞占总淋巴细胞的比例在E-T1D组最高，且与免疫相关通路上调相关；在L-T1D组最低，且与代谢过程相关；而I-T1D组则介于两组之间。多组学相互作用网络整合及实验验证表明，微生物物种Dialister invisus可能通过DPA促进外周血B细胞增殖，从而可能导致早发性T1D。综上所述，这些发现为理解与年龄相关的T1D表型提供了理论依据，并提示了精准干预的潜在靶点。