文献解读|Cell（45.1）：解码人类脑膜的时空发育

脑膜主要由三层组成——硬脑膜、蛛网膜和软脑膜——其功能是为中枢神经系统（CNS）提供机械保护、营养供应和维持体内平衡。这些功能依赖于成纤维细胞、免疫细胞、血管相关细胞等之间的相互作用。然而，由于多细胞相互作用的复杂性，全面了解人类脑膜的形成和发育仍然是一个巨大的挑战。

为了研究人类脑膜发育，研究团队首先对来自16个不同孕周（GW）的人类胚胎和胎儿的脑膜组织进行了单细胞转录组分析（scRNA-seq）（即GW8、GW10、GW12、GW14、GW16、GW21和GW23）（图1A），共获得了118696个高质量细胞数据，且来自同一孕周的样本显示出高度相关性和相似性（图1B）。这些细胞进一步聚类为七种主要细胞类型，并基于经典标记基因，分别被注释为硬脑膜成纤维细胞（fibro-dura）（DKK2和MGP）、蛛网膜成纤维细胞（fibro-ara）（PTGDS）、软脑膜成纤维细胞（fibro-pia）（NGFR）、免疫细胞（PTPRC）、壁细胞（PDGFRB）、内皮细胞（EC；CDH5）和红细胞（ALAS2）（图1B-C）。

为了确定这些细胞类型在人类脑膜中的空间分布，他们应用 Tangram 算法将它们映射到已发表的、通过单细胞空间转录组分析(scStereo-seq)数据集上（图 1D-E）。对于 GW6 的时空转录组数据，他们使用了已发表的 GW6 头部数据进行转移。此外，为了观察人类脑膜更精细的层状结构，他们还整合了来自另一项研究的多重误差稳健荧光原位杂交(MERFISH )数据（1000 个基因）（图 1F-G）。scStereo-seq和MERFISH 实验均涵盖了关键的发育阶段（GW 6-16），并清晰地揭示了发育过程中脑膜细胞类型的空间分布和时间动态变化。同时，从妊娠第8周开始，将脑膜细分为硬脑膜区（DZ）和软脑膜区（LZ）。统计分析进一步证实，fibro-dura主要位于硬脑膜区，而fibro-ara和 fibro-pia主要分布于软脑膜区（图1D-G）。综上所述，他们成功构建了人类脑膜发育的单细胞分辨率时空转录组图谱。

作为构成脑膜三层结构的基本组成部分，人类脑膜三层中成纤维细胞的形成过程和分子动力学仍有待阐明。首先，他们对GW 8-23的人类脑膜发育进行了scRNA-seq，共获得43414个脑膜成纤维细胞，并使用经典标记基因将其分为三个亚聚类（图1C），以及差异表达基因（DEG）。从这些亚聚类的差异表达基因中，他们筛选出具有特定表达模式的候选基因，用于设计MERFISH探针，最终鉴定出几个新的人类脑膜发育层标记基因。接下来，为了研究脑膜层的起始和发育，分析了之前发表的GW6的数据。出乎意料的是，通过检测各层中几个经典标记基因的表达，鉴定出了一群软脑膜成纤维细胞祖细胞。利用MERFISH进行scStereo-seq验证发现，软脑膜标记基因（如COL15A1、LAMC3、ITGA8和ITIH2）的表达在GW6即可检测到。相比之下，与其他脑膜层相关的基因——例如蛛网膜标记基因SLC22A6、SLC22A8、OSR1、GJB2和GJB6以及硬脑膜标记基因DKK2、MGP和TENT5A——在此阶段基本不表达。此外，到GW8所有三层脑膜标记基因的表达开始出现，并且开始出现初步的脑膜分层结构。从GW10开始，层特异性标记基因的分层逐渐变得清晰。到妊娠GW12-16，成纤维细胞的分层已十分明确（图2A）。免疫荧光染色显示，在GW12，p75NTR（由NGFR编码）标记的fibro-pia和GJB2及前列腺素D2合成酶（PGDS）（由PTGDS编码）标记的fibro-ara均呈现出清晰的组织分层（图2B-C）。原位MERFISH和免疫荧光染色共同证实，COL1A1（COL1A1）在fibro-dura和fibro-ara中均高表达（图2C）。这些结果表明，人类脑膜的发育是异步的。

为了阐明脑膜成纤维细胞的发育轨迹，他们分析了GW6的软脑膜成纤维细胞祖细胞和GW8-23的三层成纤维细胞。伪时序分析表明，GW6的软脑膜成纤维细胞祖细胞处于早期原始状态，与GW8的fibro-pia密切相关，这表明fibro-pia首先出现，随后是fibro-ara和fibro-dura（图2D）。

同时，他们研究了基因表达的分子动力学，发现脑膜三层中富集的多个基因（来自前50个DEG）在发育过程中呈现出时间梯度变化。具体而言，他们观察到脑膜三层中成纤维细胞的时空表达模式存在显著差异。在fibro-pia中，细胞外基质相关基因（COL15A1、COL6A1和LAMC3）表达上调，并富集于“细胞外结构组织”等生物学过程。在fibro-ara中，转运蛋白相关基因（SLC13A3、SLC7A2、SLC22A6和SLC4A4）表达升高，并与“跨越血脑屏障（BBB）的转运”相关。在fibro-pia中，骨化相关基因（MGP和SFRP2）富集，并与“血管生成的正向调控”相关。相反，一些基因在早期高表达，随后表达水平逐渐下降：例如软脑膜中的组织发育基因LUM 、蛛网膜中的代谢相关基因CMBL和离子转运蛋白OSR1，以及硬脑膜中的Wnt信号通路基因DKK2和SFRP1。这些下调基因分别富集于“纤维状胶原三聚体”、“钠离子跨膜转运蛋白活性的负调控”和“经典Wnt信号通路的正调控”等过程。这些上调和下调的基因表明，在发育过程中，脑膜的三层结构可能逐渐发生功能特化（图2E-H）。总而言之，这些结果揭示了人类三层脑膜成纤维细胞的异步起始以及发育变化的分子特征。

屏障完整性需要细胞间连接。已知纤维腺体表达紧密连接和黏附连接基因以封闭硬脑膜和蛛网膜下腔，但它们在其他脑膜层的表达尚不清楚。在此，他们分析了GW6-23期间所有三层脑膜中屏障相关基因的表达谱（图3A）。

具体而言，经典的紧密连接基因CLDN5从GW16开始在所有三层脑膜中表达，且表达量随发育而增加。CLDN11在蛛网膜和软脑膜中表达量保持较高水平，但在硬脑膜中表达量逐渐降低。与CLDN11类似，TJP1主要在蛛网膜和软脑膜中表达，而TJP2在硬脑膜和蛛网膜中表达量较低。所有三层脑膜在不同发育阶段均高表达紧密连接相关基因ACTB、ACTG1、RAC1、RHOA和CDC42。其中，RAC1、RHOA和CDC42在fibro-ara中的表达量随时间推移而降低。其他紧密连接相关基因，如RAC3、PARD3、PARD6G和PRKCI，在所有脑膜层中的表达量均极低。小鼠研究表明，CLDN11和CDH1双阳性细胞在胚胎第15天（E15）出现在蛛网膜中，标志着蛛网膜屏障的形成。在人类中，这一事件发生在妊娠第16周（GW16）。值得注意的是，CDH1在硬脑膜和软脑膜中几乎不表达。此外，他们发现主要富集于内皮细胞（EC）的黏附连接分子CDH5和PECAM1在脑膜的三层中存在差异表达，其中CDH5仅在蛛网膜成纤维细胞中低表达。然而，它们对其他黏附基因（如CTNNA1和CTNNB1）的表达较高，而CTNND1在所有层中的表达均较低。AFDN主要富集于蛛网膜，而NECTIN2在所有层中的表达水平均较低，并在发育过程中呈下降趋势。对于连接黏附分子，JAM2主要在硬脑膜和蛛网膜中表达，且表达量随时间推移而增加；而JAM3在蛛网膜中的表达量较高。间隙连接基因GJA1在硬脑膜和蛛网膜中高表达，但在软脑膜中的表达量随着发育的进行而降低。与GJA1不同，GJB6几乎只在fibro-ara中表达，且表达量随时间显著增加。关于转运蛋白相关基因，SLC1A3主要在蛛网膜和软脑膜中表达。有趣的是，其在蛛网膜中的表达显著降低，但在软脑膜中的表达逐渐升高。此外，SLC38A2、SLC44A1、LEPR和INSR主要富集于硬脑膜和蛛网膜，而LRP1在整个发育过程中均在所有三层组织中高表达（图 3A）。最后，他们使用 MERFISH 技术验证了这些屏障相关基因的表达动态。总的来说，这些屏障相关基因不仅在fibro-ara中表达，也在fibro-pia和 fibro-dura中表达。

神经递质转运蛋白通过快速清除突触间隙的神经递质来调节神经稳态和可塑性，从而实现精确的信号终止。通过scRNA-seq分析，发现fibro-ara和fibro-pia表达神经递质转运蛋白相关基因，例如SLC6A1、SLC6A13和SLC1A3，这些结果已通过MERFISH技术验证（图3A），并与之前的研究结果一致。虽然早期研究表明突触基因SYT1主要在神经元中表达并调节囊泡释放，但他们也在fibro-ara和fibro-pia中检测到了SYT1的表达（图3A）。为了客观比较这些基因在脑膜成纤维细胞中的表达水平，他们利用已发表的皮质数据集中的scRNA-seq数据，对脑膜成纤维细胞三层、实质神经元和星形胶质细胞祖细胞（APC）中SLC6A1（GAT - 1）、SLC6A13（GAT-2）、SLC6A11（GAT-3）、SLC1A3（GLAST-1）和SYT1的转录谱进行了比较分析。分析结果显示，SLC6A1在fibro-pia和fibro-ara中的表达显著高于神经元；SLC6A13主要在fibro-pia和fibro-ara中表达，在其他细胞类型中的表达可忽略不计，这与之前的报道一致；SLC6A11在发育过程中几乎不在这些细胞类型中表达；SLC1A3在fibro-pia中表达最高，在APC中也观察到相当高的表达水平；SYT1在神经元中高表达，但在fibro-ara和fibro-pia中表达相对较低（图3B）。最后，他们进行了免疫荧光染色，以验证GAT-1（SLC6A1）、GAT-2（SLC6A13）、GLAST-1（SLC1A3）和SYT1与成纤维细胞标记物以及神经元/APC标记物在蛋白水平上的共定位（图3C-F）。

已知与脂质代谢相关的基因支持屏障发育，这些基因在脑膜发育过程中富集（图2E）。对脑膜各层中这些通路进行分析发现，APOD、APOE和LRP1高表达，而其他基因表达水平较低（图3G）。MERFISH证实了这些基因在GW6-16的表达，其中APOE始终保持高表达水平（图3H）。

接下来，他们重点研究了脑膜免疫细胞，因为它们在维持大脑稳态方面发挥着不可或缺的作用。值得注意的是，他们观察到发育中的人类脑膜免疫细胞具有显著的异质性，这些细胞进一步分为10个聚类：脑膜巨噬细胞（MM；MRC1和F13A1）、单核细胞（CD14和MSR1）、树突状细胞（DC；CD1C）、单核细胞祖细胞（MP；CD14、HLA -DRA、LYZ和S100A8）、肥大细胞（CPA3）、粒细胞-巨噬细胞祖细胞（GMP；MPO、MS4A3、ELANE和AZU1）、巨核细胞（MK；PF4、GP9和GATA1）、自然杀伤细胞（NK细胞；NKG7）和T细胞（IL7R）和B细胞（CD79B）（图4A-B）。在这些细胞聚类中，MM细胞占所有免疫细胞的50%以上，scStereo-seq分析也支持了这一结果（图4C-D）。接下来，他们对发育过程中不同免疫细胞亚聚类在LZ和DZ区域的比例分布进行了统计分析。结果表明，所有免疫细胞亚聚类都存在于硬脑膜和软脑膜中。但在发育早期，免疫细胞亚聚类主要定位于LZ，而随着发育的进行，它们在DZ中的比例逐渐增加。鉴于其比例较高、时空异质性变化显著（图4C-D），且大多数功能仍不清楚，他们将MM进一步细分为四个亚群：增殖性MM、炎症基因高表达（IFH）MM、血管生成相关基因高表达（AH）MM和胶原基因高表达（CH）MM。增殖性MM表达增殖相关标志基因（MKI67和PCLAF）。这些细胞参与了包括“有丝分裂核分裂”在内的多种过程。IFH MM显示出免疫相关基因（S100A9和TIMD4）的高度富集，并在“先天免疫反应调节”和“内吞作用调节”等过程中发挥作用。AH MM 强烈表达促血管生成基因（VEGFA），表明它们可能在调节脑膜血管化中发挥作用。CH MM的特征是胶原合成相关基因（COL1A2和RCN3）的高表达，并富集了“参与形态发生的发育生长”和“细胞-基质粘附的正向调节”（图 4E）。同时，免疫荧光染色验证了这四个 MM 亚聚类的存在（图4H-K）。他们还对这四个 MM 亚聚类的标记物的免疫荧光染色结果进行了定量分析。在对这些亚群的比例进行标准化后，他们发现这些标记阳性细胞的相对频率与scRNA-seq数据基本一致（图4F-L）。有趣的是，通过与已发表的其他组织巨噬细胞数据进行比较，并评估胶原相关基因的表达，他们推测它们代表了一个脑膜特异性巨噬细胞亚群，可能由独特的脑膜微环境塑造而成。鉴于脑膜成纤维细胞分泌大量胶原蛋白，这可能导致CH MM检测出现假阳性结果，他们进一步采用MERFISH技术检测了COL1A1/COL1A2转录本的原位表达。结果显示，COL1A1或COL1A2转录本与MRC1+/F13A1+ MM共定位。值得注意的是，在这些MM的细胞核内也检测到了转录信号，进一步排除了由于细胞边界模糊而导致的细胞质信号引起的假阳性（图4 M）。

他们进一步研究了MM亚聚类在不同发育阶段的时间动态变化。值得注意的是，增殖性MM和IFH MM的比例随着发育逐渐降低，而AH MM和CH MM的比例则逐渐升高（图4F）。此外，对发育轨迹的拟时序分析表明，增殖性MM和IFH MM的成熟度较低，而AH MM和CH MM的成熟度较高。拟时序轨迹与实际发育阶段相吻合（图4G）。作为脑内驻留巨噬细胞，他们进一步比较了MM和小胶质细胞在发育上的异同。首先，纳入了GW6卵黄囊（YS）和头部样本中的早期巨噬细胞群。在GW6时，早期YS巨噬细胞与头部巨噬细胞的相似性最高。在GW8，MM细胞和小胶质细胞均与妊娠第6周（GW6）的祖细胞较为相似，这进一步表明它们可能都起源于卵黄囊原始巨噬细胞。接下来，从GW8开始，这两种细胞类型开始高表达不同的特征基因。例如，MM细胞高表达F13A1、MRC1和LYVE1，而小胶质细胞则富集P2RY12、P2RY13、C3和CX3CR1等基因，并且基因表达的发育差异逐渐变得更加显著。从GW10开始，小胶质细胞开始高表达细胞因子CCL3、CCL4和CCL3L1，以及激活相关基因APOE和LGALS3。有趣的是，他们发现，在妊娠第8至23周（GW8-23），MM高表达细胞骨架相关基因VIM36，这表明MM具有更高的流动性、更松散的细胞间连接和更强的迁移能力。与小胶质细胞相比，MM高表达胶原相关基因COL1A2和RCN3。这种现象可能是由脑膜特有的微环境引起的，这与前面提到的脑膜特异性CH MM一致（图4N）。从GW8开始，随着发育的进行，MM和小胶质细胞之间的差异越来越大。然而，在GW23之后，与GW16相比，两种细胞类型之间的差异缩小（图4O）。这可能是由于小胶质细胞在建立稳态后短暂地脱离稳态所致。此外，空间可视化结果证实了MM亚聚类的动态变化（图4P）。有趣的是，随着发育的进行，所有MM亚聚类均表现出在LZ区域内的优先分布（图4P-Q）。这种特定的定位表明，LZ来源的信号可能在早期阶段介导了这些MM亚聚类的募集。

作为脑膜的主要结构框架，他们首先利用 CellChat 分析了脑膜成纤维细胞向脑膜免疫细胞和小胶质细胞传递的信号通路。他们发现脑膜成纤维细胞激活了CXCL12-CXCR4 通路，该通路可激活包括巨噬细胞、B 细胞、T 细胞等在内的多种免疫细胞（图 5 A）。虽然之前的研究报道了该通路在成年脑膜中对免疫细胞的滞留作用，但他们进一步验证了该信号通路在发育中的人类脑膜中的作用。此外，在发育中晚期（GW23），小胶质细胞也会被 CXCL12-CXCR4 通路激活。接下来，他们分析了来自三层脑膜的成纤维细胞和软脑膜成纤维细胞祖细胞中趋化因子家族的表达。值得注意的是，与其它成纤维细胞相比，fibro-pia中CXCL12的表达水平更高，并在GW16达到最高水平。此外，scStereo-seq学数据也证实了CXCL12在整个发育过程中表达升高。随后，他们进一步检测了脑膜成纤维细胞和MM亚群中CXCL12-CXCR4亚基的表达。首先，他们采用scStereo-seq技术和MERFISH技术，定量分析了不同发育阶段LZ和DZ中四个MM亚群的CXCR4表达。结果显示，除增殖期MM亚群外，所有其他亚群在LZ中的CXCR4表达均高于DZ。值得注意的是，AH MM亚群的CXCR4表达最高。同时，发现fibro-pia通过该信号通路与IFH MM和AH MM均表现出更强的相互作用（图5A）。最后，scStereo-seq和MERFISH分别验证了fibro-pia中CXCL12的表达以及IFH MM和AH MM中CXCR4的表达（图5B-C）。

他们首先利用已发表的小鼠scRNA-seq数据检测了CXCL12的表达。与人类scRNA-seq数据一致，CXCL12在fibro-pia中的表达高于fibro-dura和fibro-ara，这一结果也通过E15.5小鼠的免疫荧光染色得到验证。随后，他们构建了成纤维细胞特异性条件性敲除（cKO）CXCL12的小鼠。为了验证cKO的效率，他们检测了E15.5 cKO小鼠脑膜组织中CXCL12外显子2的mRNA表达，结果显示其表达几乎检测不到，表明小鼠脑膜成纤维细胞中CXCL12的cKO是有效的。值得注意的是，与对照组小鼠相比，cKO小鼠的LZ区域内MM数量显著减少（图5 D-E）。此外，他们利用Transwell小室进行体外趋化性实验，上室接种诱导的人巨噬细胞。结果证实，CXCL12蛋白阳性对照组能有效趋化巨噬细胞。同时，与普通培养基对照组相比，接种人原代脑膜成纤维细胞的组显著诱导了人巨噬细胞的趋化性；然而，在CXCL12敲低（KD）组中，这种趋化能力显著减弱（图5F）。因此，这些结果强烈提示，fibro-pia可能分泌趋化因子CXCL12，从而调节间质细胞在白质区的募集和优先分布。

鉴于IFH MM构成介导免疫功能的主要亚聚类，他们接下来重点研究了它们在神经发育中的作用。他们检测了IFH MM中膜受体基因的表达。值得注意的是，关键的膜受体基因——髓系细胞触发受体2（TREM2）在IFH MM中高表达（图6 A），免疫荧光染色结果进一步证实了这一点（图6 B）。据报道，TREM2在多种神经退行性疾病、癌症和代谢紊乱的发病机制中发挥着复杂而关键的作用。在本研究中，他们探讨了IFH MM中TREM2的高表达是否调控神经发育。

为了研究TREM2介导的MM在脑发育中的作用，他们首先证实了小鼠IFH MM中Trem2的高表达。然后，他们构建了髓系细胞特异性Trem2敲除小鼠。在E15.5时进行髓系细胞特异性Trem2敲除，导致软脑膜下Reelin阳性Cajal-Retzius (CR)细胞的数量显著减少，以及与对照组相比，CR细胞连接断裂的比例增加。鉴于小胶质细胞和MM具有共同的前体细胞，他们旨在排除Trem2对小胶质细胞的影响。因此，他们将Trem2 fl/fl小鼠与Mrc1-CreER小鼠杂交，构建了可诱导的Trem2条件性敲除小鼠（cKO），该小鼠特异性靶向巨噬细胞。正如预期，在胚胎第15.5天（E15.5）的MM中敲除Trem2基因导致CR细胞的数量和连续性发生改变，这与在E15.5的髓系细胞中敲除Trem2基因的观察结果一致（图6C-E）。此外，还检测了巨噬细胞中敲除Trem2基因是否会影响脑膜CXCL12的表达。结果显示，在Trem2 cKO小鼠的脑膜成纤维细胞中，CXCL12的表达没有显著变化。

接下来，他们试图探索TREM2介导的CR细胞发育调控的分子机制。通过整合scRNA-seq和scStereo-seq数据，绘制了大脑皮层（Cor）主要细胞类型的空间分布图，包括谷氨酸能（gluta）神经元、GABA能（GABA）神经元、神经祖细胞（NPC）、少突胶质细胞前体细胞（OPC）、APC、EC、壁细胞和小胶质细胞。对于谷氨酸能神经元，他们进一步将其细分为三个亚聚类——Cor gluta1、Cor gluta2和CR细胞，分别对应于之前研究中的C1、C4和C15。然后，可视化了人脑发育过程中IFH MM和三个谷氨酸能神经元亚聚类的空间分布（图6 F）。正如预期，CR细胞位于Cor的最外层边缘区（MZ），并且与IFH MM在空间上最为接近（图6F-G）。随后，他们利用scRNA-seq数据，通过与脑膜成纤维细胞和小胶质细胞进行比较，鉴定了靶向谷氨酸能神经元的IFH MM特异性信号通路（图6H）。该分析鉴定出几个特异性的配体-受体对，包括LRRC4-NTNG2、HBEGF-EGF、F11R-JAM3、CXCL8-ACKR1、CCL2-ACKR1和CCL13-ACKR1。

为了验证TREM2介导的MM是否调控小鼠体内的这些信号通路，他们富集了E15.5 Trem2髓系特异性敲除小鼠的CD206 + MM。然后，对这些MM进行了转录组分析（RNA-seq），发现MM中Trem2的敲除显著下调了Ccl2的表达，实时定量PCR也证实了这一结果（图6 I-J）。同时，免疫荧光染色显示，在E15.5 IFH MM中敲除Trem2后，IBA1+ MM中CCL2蛋白水平显著降低。他们还使用ELISA检测了脑脊液（CSF）中CCL2蛋白的水平。IFH MM中Trem2的敲除同样导致CSF中CCL2水平显著降低。免疫荧光染色进一步证实了软脑膜邻近的MM细胞和CR细胞中存在CCL2-ACKR1配体-受体蛋白的表达。MERFISH也证实了这种配体-受体对的表达。

为了研究TREM2调控MM中CCL2表达的机制，他们筛选了MM中Trem2敲除后表达下调2倍以上的转录因子，并检测到Nfya显著下调（图6K）。核转录因子Y亚基α（NFYA）是NF-Y三聚体复合物（NFYA/YB/YC）的DNA结合亚基，它识别并结合启动子区域的CCAAT盒，从而调控参与增殖和肌肉分化的基因转录。虽然现有证据表明NFYA可能直接或间接调控趋化因子表达，但其在调控CCL2中的作用尚未见报道。分别进行了免疫荧光染色以确认小鼠和人MM中NFYA的表达，并进一步观察到在MM中敲除Trem2后，软脑膜邻近的IBA1 +巨噬细胞中NFYA蛋白表达下调（图6L-M）。然而，NFYA在调控CCL2表达中的作用尚未见报道。鉴于NFYA的特性，他们推测NFYA可能与CCL2启动子结合以调控其表达。染色质免疫沉淀（ChIP）实验证实NFYA与CCL2启动子-1 kb区域存在强结合（图6 N）。为了进一步验证NFYA在CCL2分泌中的关键作用，他们进行了ELISA检测，以定量诱导的小鼠巨噬细胞培养上清液中分泌的CCL2蛋白水平。值得注意的是， Trem2和Nfya同时缺失会抑制 CCL2 的分泌，而Nfya的过表达则能恢复Trem2敲低组中 CCL2 的水平，表明 TREM2 通过 NFYA 调控 CCL2 的分泌（图 6O）。综上所述，这些结果表明，在 IFH MM 中，TREM2通过转录因子 NFYA 调控 CCL2 的分泌。

脑膜为脑实质供血已得到充分证实，时空数据进一步证实了人脑膜EC的丰富性（图1B-G）。首先，将脑膜EC进一步分为7个亚群（图7A）。动脉EC高表达动脉标志物FBLN5、GJA4、HEY1和DLL4。静脉EC高表达已报道的标志物ADGRG6，以及DUSP2和ADM的表达水平升高。相比之下，顶端细胞的特征是标志基因PGF以及新发现的基因（如CHST1和COL15A1）的表达水平升高。毛细血管EC表达毛细血管标志物CA4以及DPEP1。静脉和毛细血管内皮细胞均高表达已报道的标志物SLC16A1。淋巴管内皮样细胞（LEC）不仅特异性表达经典的LEC标志物LYVE1和MMRN1，而且高表达基因ACKR1。值得注意的是，LEC也高表达静脉内皮相关基因。增殖性EC由经典的增殖标志基因TYMS和MKI67定义。线粒体相关（MT）EC富集表达MT基因，包括TTN和MALAT1，代表一个质量相对较低的亚聚类。GO分析表明，这些内皮细胞亚聚类参与血管发育的多种过程。

此外，他们还探讨了内皮细胞亚群的时空发育变化。随着脑膜发育的进行，增殖性EC、静脉EC和淋巴EC的比例逐渐下降，而动脉EC和毛细血管EC的比例则逐渐上升。这些内皮细胞亚群的空间分布图进一步显示，它们在早期主要分布于层状区（LZ）；然而，随着发育的进行，一些亚群（顶端细胞和增殖性内皮细胞）的分布逐渐向暗区（DZ）扩展（图7 B-C）。

MM在脑膜血管生成中的调控作用仍不甚明了。首先，利用scStereo-seq验证了AH MM与EC亚群之间的空间邻近性（图7D）。随后，通过对scRNA-seq数据的细胞间相互作用分析，他们鉴定出两个经典的血管生成相关信号通路：VEGFA-FLT1和VEGFA-KDR，它们由房水间充质细胞靶向EC亚群介导（图7E）。更重要的是，他们发现AH MM介导的VEGFA信号通路在不同的脑膜EC亚群中相互作用强度存在差异。具体而言，VEGFA-FLT1信号通路在动脉EC中更强，而VEGFA-KDR在毛细血管EC和顶端细胞中表达更高。接下来，利用MERFISH技术验证了这两个通路的表达（图7F-G）。免疫荧光染色进一步证实了AH MM和EC亚聚类中VEGFA及其受体（VEGFR1或VEGFR2）的表达（图7H-I）。此外，体外功能验证实验表明，诱导的人巨噬细胞显著促进了EC增殖；然而，敲低这些巨噬细胞中的VEGFA显著减弱了这种增殖作用（图7J-K）。因此，这些结果表明，诱导的巨噬细胞通过分泌VEGFA促进EC增殖，而AH MM的体内功能仍需进一步研究。

为了评估脑膜淋巴管的发育，采用MERFISH技术可视化脑膜中LEC的解剖结构。结果显示，MMRN1和ACKR1阳性的内皮细胞不仅存在于皮肤和颅骨中，也存在于脑膜的三层结构中（图7L）。此外，他们发现发育过程中LEC分布于LZ和DZ，且比例相当。同时，进一步监测了免疫相关细胞向LEC的信号传导。结果显示，在富集的信号通路中，大多数免疫细胞激活了LEC中的ITGB2-ICAM1/2信号通路。已发表的研究充分证实，该通路对于白细胞跨淋巴管内皮迁移至关重要，并进一步提示脑膜发育过程中免疫细胞与LEC之间可能存在相互作用。

本研究利用GW6-23的多组学数据，揭示了脑膜各层发育的异步性，其中软脑膜最早形成。定义了三层脑膜中各层特异性的成纤维细胞状态，包括屏障相关基因、神经递质转运相关基因、突触相关基因以及脂质代谢相关基因的表达。此外，还表征了脑膜免疫细胞的时空异质性，并鉴定出一种脑膜特异性巨噬细胞群。软脑膜通过CXCL12-CXCR4信号通路募集并空间组织免疫细胞，特别是软脑膜中的巨噬细胞。此外，Trem2+巨噬细胞反过来又调控大脑皮层中CR细胞的发育。这些发现为人类脑膜发育建立了一个时空框架，揭示了塑造皮层发育的神经免疫相互作用，并确定了潜在的治疗靶点。