文献解读|Nat Aging（25）：血浆蛋白质组学框架可预测代谢功能障碍相关的脂肪肝疾病，最早可在发病前16年进行预测

代谢功能障碍相关性脂肪肝（MASLD）已成为全球最常见的慢性肝病之一，其病因是代谢紊乱、生活方式暴露、遗传易感性和全身炎症等多种因素的复杂相互作用。MASLD 不仅表现为肝脂肪变性，更是一种进行性多系统疾病，可发展为肝纤维化、肝硬化、肝细胞癌，并最终导致肝脏相关死亡。据估计，到 2021 年，MASLD 的全球患病率将接近 25%，MASLD 及其并发症已成为全球心血管代谢疾病和肝脏疾病负担的主要因素。在全球人口老龄化的背景下，心血管代谢疾病负担的累积以及与年龄相关的生理变化正日益影响着 MASLD 的风险格局，因此，在出现明显的临床症状之前，尽早识别高危人群至关重要。

研究团队开展了一项多国蛋白质组学研究，随访时间长达16年，整合了不同人群的血浆蛋白质组学分析和临床表型数据，旨在识别与未来MASLD发生相关的循环蛋白质组学生物标志物，并建立基于蛋白质的模型，用于长期预测MASLD的发生。

共有37966名基线无MASLD的参与者从英国南部17个城市入组，组成英国南部队列。此外，为了进一步验证结果，还从英国北部5个城市招募了14986名参与者，组成英国北部队列。另外两个验证队列分别是欧洲癌症与营养前瞻性研究-诺福克（EPIC-Norfolk，n  = 2944）队列和中国南方起始队列（SCIC，n  = 100）。英国南部队列和英国北部队列的参与者年龄和性别分布相似，基线MASLD患病率也相近。在英国的两个队列中，与未患MASLD的参与者相比，发生MASLD的参与者基线BMI更高，高血压和糖尿病的患病率也更高（所有标准化均值差。在16.6年的随访期间，英国南部队列共发现572例新发MASLD病例，而英国北部队列则发现210例。对于EPIC-Norfolk队列的参与者，发生MASLD的参与者年龄较小，基线体重指数（BMI）更高（29.9 kg/m² vs. 26.5 kg/m²）。同样，在SCIC队列中，发生MASLD的参与者基线BMI也高于未发生MASLD的参与者（25.3 kg/m² vs. 22.9 kg/m²）。

本研究使用基于抗体双重识别和DNA扩增的邻近延伸分析（PEA）的Olink蛋白质组学平台，共检测了2737种血浆蛋白（图1）。其中，323种蛋白在校正年龄、性别、自述种族、教育水平、家庭收入、汤森剥夺指数（TDI）、BMI、饮酒频率、吸烟习惯、饮食习惯、高血压、糖尿病和体力活动等因素后，与新发MASLD显著相关（图2a）。在所有测试的蛋白质中，岩藻糖变旋酶 (FUOM)、天冬氨酸酰化酶-1 (ACY1)、谷胱甘肽水解酶 1 前体酶 (GGT1)、钙黏蛋白相关家族成员 2 (CDHR) 和 I 型细胞骨架角蛋白 18 (KRT18) 是与 MASLD 发病率最显著相关的五种蛋白质。

对 323 个显著蛋白质进行功能富集分析显示，与代谢调节和免疫信号传导相关的通路显著富集，包括代谢通路、IL-10 信号传导、氧化还原酶活性和溶酶体过程（图2b）。

为了确定最佳生物标志物组合，他们首先根据统计学显著性对与新发MASLD显著相关的323种血浆蛋白进行优先级排序，然后采用顺序前向选择法进行筛选。使用曲线下面积（AUC）评估模型的区分度，并在每一步应用DeLong检验来评估增量改进。当连续两次添加蛋白均未观察到显著的AUC增益时，选择过程终止，最终得到一个包含FUOM、ACY1、GGT1、CDHR2和KRT18的简约五蛋白模型。除了该最优模型外，还评估了一个包含30种蛋白的扩展组合（图S1）。使用自举法在英国南部队列中对模型性能进行了内部验证（图3）。在使用上述选定的各个蛋白质建立的预测模型中，预测 5 年内 MASLD 的发病表现最为突出：仅血浆 CDHR2（AUC = 0.812）、仅血浆 GGT1（AUC = 0.797）、仅血浆 FUOM（AUC = 0.791）、仅血浆 KRT18（AUC = 0.789）和仅血浆 ACY1（AUC = 0.777）（图3b）。在其他时间窗口内，单个蛋白质的预测能力仍然保持稳定：10 年内（CDHR2，0.742；GGT1，0.726；FUOM，0.739；KRT18，0.739；ACY1，0.729）（图3c），超过 10 年（CDHR2，0.681；GGT1，0.687；FUOM，0.721；KRT18，0.708；ACY1，0.730）（图3d）和总体（CDHR2，0.715；GGT1，0.709；FUOM，0.732；KRT18，0.726；ACY1，0.731）（图3a）。五蛋白组合在多个预测周期内均表现出稳健的预测性能，5年内AUC为0.838，10年内为0.772，10年以上为0.742（图3）。扩展的30蛋白组合进一步提升了预测性能，5年内AUC为0.889，10年内为0.823，10年以上为0.769，所有随访期AUC均为0.789。与临床预测因子整合后，模型区分度进一步提高。联合五蛋白模型在5年内AUC为0.904，10年内为0.848，10年以上为0.799，所有随访期AUC均为0.822。包含30种蛋白质的联合模型分别实现了0.917、0.860、0.811和0.829的相应AUC值。相比之下，仅基于MASLD多基因风险评分（PRS）的单变量模型仅具有有限的预测能力（AUC 0.511-0.526），这凸显了基于蛋白质的模型具有更优的预测价值。

在英国北部队列中，经验证，排名前五的蛋白质在多个时间段内（包括整个随访期、5年内和10年内）预测MASLD新发病例的AUC均大于0.7。在独立的EPIC-Norfolk队列（随访16.6年）中，这五种蛋白质组合预测所有时间段MASLD新发病例的AUC为0.710（图3e）。这些结果支持该组合在不同长期队列中的稳健性和普适性。在SCIC队列中，这五种蛋白质组合的AUC达到0.912，进一步证明了该模型的普适性。在各个蛋白质中，ACY1 的区分度最高（AUC = 0.830），其次是 FUOM（0.754）、KRT18（0.681）、GGT1（0.673）和 CDHR2（0.561）（图3f）。

采用累积风险曲线评估英国生物银行（UKB）人群中基线血浆蛋白水平高低对发生MASLD风险的影响（图4a-e）。基线蛋白水平按五分位数分组，并绘制累积风险曲线。通过风险比评估整个随访期间基线血浆蛋白水平最低五分位组（Q1）与最高五分位组（Q5）之间发生MASLD的风险。与Q1水平的参与者相比，基线CDHR2、FUOM、KRT18、ACY1或GGT1蛋白水平处于Q5的参与者发生MASLD的风险升高。

他们构建了后来发展为MASLD的参与者的群体水平蛋白质浓度时间轨迹，并将其与UKB人群中在诊断前16年期间未患MASLD的参与者的轨迹进行了比较。病例组和非MASLD对照组按年龄、性别和基线BMI以1:5的比例进行匹配（图5a-e）。局部加权散点平滑曲线显示，在随后发展为MASLD的个体中，五种蛋白质（FUOM、ACY1、GGT1、CDHR2和KRT18）的水平持续升高。

使用从英国南部队列的五蛋白预测模型中得出的最佳概率值，将参与者分为高风险组和低风险组。Kaplan-Meier 分析显示，两组间 MASLD 累积发病率存在显著差异。在英国南部队列中，与低风险组相比，高风险组个体发生MASLD的风险显著升高，在英国北部队列中也观察到类似结果（图S1a）。同时，血浆FUOM、ACY1、GGT1、CDHR2和KRT18的组水平时间轨迹显示，在MASLD诊断前16年内，高风险组和低风险组之间存在明显且持续的差异（图S1b）。综上所述，这些结果表明，该五蛋白模型不仅可以对长期MASLD风险进行分层，还可以捕捉临床诊断前早期且持续存在的蛋白质组学差异。

接下来，他们研究了五种关键蛋白的时间轨迹及其预测性能是否因年龄组而异。使用两种预定义的分层方案进行年龄分层分析：按基线年龄四分位数分层和按队列中位年龄以及50岁的固定截断值分层。在按年龄四分位数分层的分析中，分别针对最年轻（Q1）和最年长（Q4）的年龄组重建了FUOM、ACY1、GGT1、CDHR2和KRT18的组水平时间轨迹。在两个年龄极端组中，随后发展为MASLD的个体在整个诊断前阶段均表现出比对照组更高的蛋白丰度，这与在整个队列中观察到的模式非常吻合（图S2a-b）。

与这些轨迹分析结果一致，按年龄分层的受试者工作特征曲线（ROC）分析显示，五蛋白组合在不同年龄组中保持了相似的鉴别性能。以队列中位年龄为分层标准，该五蛋白模型对所有新发MASLD病例的AUC值约为0.75（图S2）。当以50岁为固定年龄分界点进行分层时，也观察到了类似的结果（图S3）。综上所述，这些结果表明，五蛋白组合的时间蛋白轨迹及其预测性能在成人年龄组中基本一致。

本研究表明，在来自英国南部、英国北部、EPIC-Norfolk队列和中国南方队列的5万多名参与者中，鉴定并验证了由五种血浆蛋白（FUOM、ACY1、KRT18、CDHR2和GGT1）组成的蛋白组，该蛋白组可作为MASLD的预测标志物。五蛋白模型在5年曲线下面积（AUC）为0.838，在16.6年AUC为0.756，且在EPIC-Norfolk队列中纵向预测性能稳定（16.6年AUC = 0.710），并在中国南方初始队列中得到验证（AUC = 0.912）。将这些生物标志物与常规临床数据整合可进一步提高预测性能（5年AUC=0.904；16.6年AUC=0.822）。这些发现建立了一个可扩展的蛋白质组学框架，用于在MASLD临床发病前16年进行超早期风险分层和靶向干预。