文献解读|Cancer Cell（56.1）：结直肠癌大转移和微转移的空间多组学图谱

虽然早期筛查显著降低了局限性结直肠癌 (CRC) 的发病率，但对驱动结直肠癌转移的生物学机制的了解仍然有限，这仍然是提高长期生存率的主要障碍。微小残留病灶 (MRD) 是指在无影像学或临床疾病证据的情况下，循环肿瘤 DNA (ctDNA) 的存在，它已是公认 CRC 复发的先兆，近期临床试验和 FDA 关于 ctDNA 在药物研发中的应用指南均支持这一观点。基于 ctDNA 的 MRD 检测方法发展迅速并已应用于临床，但 MRD 的肿瘤组织相关性仍不甚明了。结直肠肝微转移灶 (CLiMi) 是指肉眼观察正常的肝组织中存在的微小肿瘤灶，且组织学上与结直肠肝大转移灶 (CLiMa) 相距甚远，它是预后不良的强预测因子。这些亚放射学病灶代表了肿瘤在血管丰富的肝窦和门脉区内的微观扩散，它们的存在提示远处转移的可能性增加，支持其作为微小残留病灶（MRD）组织替代物的潜力。然而，要将CLiMi确立为MRD的组织替代物，需要进行详细的分子表征，以区分CLiMi和CLiMa，并识别与侵袭性生物学和基于ctDNA的MRD相关的CLiMi特异性改变。

为了全面表征转移性和原发性结直肠癌的分子图谱和空间结构，并确定CLiMi特异性分子改变的生物学和临床意义，研究团队构建了一个包含19例结直肠癌患者的空间多组学数据集（图1A）。该队列包括37个采用Visium空间转录组学（ST）技术进行分析的样本、12个采用Visium HD ST进行分析的样本、6个采用激光捕获显微切割结合全基因组测序（LCM-WGS）进行分析的样本，以及17个采用PhenoCycler-Fusion超高通量蛋白成像技术进行分析的样本（图1B）。对于单细胞转录组分析（scRNA-seq），他们整合了来自4个内部肝转移瘤样本和3个来自基因表达综合数据库（GEO）的公共数据集的scRNA-seq数据：GSE231559（9个肝转移瘤样本和6个原发性结直肠癌样本）、GSE225857（4个肝转移瘤样本和4个原发性结直肠癌样本）和GSE285991（10个肝转移瘤样本）（图1B）。对于整体转录组分析，他们纳入了117个经转录组分析(RNA-seq)分析的MDACC肝转移瘤样本和170个来自GEO的肝转移瘤样本：GSE131418，该样本经微阵列分析。进一步整合了主要 CRC 队列，包括通过 RNA-seq 分析的 610 个 TCGA-CRC 样本和两个独立的微阵列数据集，GEO: GSE17538 (n=232) 和 GEO: GSE21510 (n=146)（图 1 B）。

对于空间多组学分析，根据一系列预定义的标准选择了切除的CLiMa（27个病灶）和CLiMi（47个病灶），以及匹配的切除肺大转移灶（CLuMa，4个病灶）、微转移灶（CLuMi，6个病灶）和原发性CRC（12个病灶）（图1 C）。为了验证大转移灶和微转移灶的病理分类，他们基于转录组谱和转移灶的物理大小，使用k均值聚类和高斯混合模型（GMM）对Visium和Visium HD ST数据集进行了无监督聚类。共有341328个空间分辨Visium ST斑点（直径55 μm）纳入后续分析，病理标注分成三个层级（图1D）。第一层根据肿瘤位置对斑点进行分类：CLiM（n = 234051）、CLuM（n = 46476）和原发性CRC（n = 60801）。第二层将斑点分类为肿瘤、非肿瘤、坏死组织或其他。第三层进一步将斑点细分为25种组织学成分（图1D）。排除坏死区域后，每个斑点中RNA分子和检测到的基因的中位数分别为24665和6323.5，表明数据质量较高（图1D）。同样，对于九个内部Visium HD ST数据集及其匹配的高分辨率H&E染色图像，他们进行了详细的病理注释，包括CLiM和原发性CRC（图1E）。这些注释的空间可视化能够清晰地描绘出不同样本的组织学结构（图1F-G）。接下来，他们将这些病理注释与组织结构和基因表达谱整合，从而表征CLiM、CLuM和原发性CRC组织中克隆结构、转录组程序和通路活性的空间动态变化。

为了绘制肿瘤细胞富集区域的空间克隆结构，他们推断了拷贝数变异（CNV），以评估原发性和转移性CRC中的全基因组改变，揭示了肿瘤区域广泛的染色体增益和缺失（图2A），而非肿瘤区域（“正常”）未显示任何改变，因此可将其用作参考对照。鉴于具有相似CNV谱的斑点可能具有共同的起源，重建了系统发育树以确定肿瘤的进化轨迹。

两名患者（Pat1 和 Pat6）分别患有匹配的原发性CRC、CLiM 和 CLuM，其进化轨迹截然不同（图 2A）。在 Pat1 中，所有部位的恶性细胞在多个染色体上（例如 1p、3p、7、17、18 和 20）均存在主要的CNV。然而，原发性 CRC 和 CLuM 表现出高度相似的 CNV 谱，而 CLiM 的 CNV 变异较少（图 2A）。原发性 CRC 中的优势克隆（C5-C6）和 CLuM 中的优势克隆（C4）表现出广泛的 CNV，而 CLiM 中的优势克隆（C1-C3）的 CNV 变异较少（图 2A）。值得注意的是，CLiMi 病灶与 CLiMa 共享克隆 C1，提示它们可能具有共同的起源。CytoTRACE 分析表明，与原发性 CRC 相比，CLiM 和 CLuM 的分化程度较低（图 2A）。相比之下，Pat6 中原发性 CRC (C5–C6) 和 CLiM (C7–C8) 克隆之间存在部分重叠，多个染色体（例如 5、7、13、17、18 和 20）上存在共享的 CNV。两个 CLiM 样本具有相似的克隆结构。然而，CLuM 包含不同的克隆 (C1–C4)，这些克隆重叠有限，且 CNV 更为广泛。CytoTRACE 分析进一步显示，与匹配的原发性 CRC 和 CLiM 样本相比，CLuM 中分化程度较低的细胞比例更高。在空间上，Pat1 中 CLiM 优势克隆彼此分离，但具有相似的 CNV 谱，表明其在肝脏内存在平行进化。在Pat6和其他患者的原发性CRC、CLiM和CLuM样本中均观察到了类似的空间分离现象。这些发现凸显了转移演化的复杂性以及患者间克隆动态的异质性。

为了验证推断的CNV模式，他们使用LCM-WGS进行了正交分析（图2B）。基于空间推断CNV的结果，他们选取了六个代表性病例，对来自同一克隆区域的相邻切片进行LCM-WGS分析。所得数据揭示的CNV图谱与Visium ST数据推断的图谱高度一致（图2C），这支持了空间CNV推断的稳健性和准确性。

系统发育分析显示，CLiMi 在多例患者（Pat1、3-7、9-11）中均位于早期进化分支（图 2A）。CNV 负荷、CytoTRACE 推断状态和基因特征（静止、分化、增殖）的比较表明，与 CLiMa 相比，CLiMi 的 CNV 评分和 CytoTRACE 评分均较低，而分化和静止评分较高（图 2D-H）。在四对匹配的 CLiMa-CLiMi 样本中，使用 MEDICC2 重建的克隆系统发育树以及来自 LCM-WGS 的 CNV 分析进一步支持了 CLiMi 位于早期分支且 CNV 负荷较低的结论（图2I）。为了进一步研究细胞状态，他们对匹配的CLiMi和CLiMa样本进行了Ki-67和干细胞标志物SOX2的多重免疫染色，观察到CLiMi中SOX2的表达较CLiMa中略强，而两组间Ki-67水平无显著差异（图2J-K）。CLiMi中SOX9（一种公认的结肠上皮干细胞标志物）的表达显著高于CLiMa，进一步支持了微转移病灶的干细胞样表型。综上所述，这些结果表明CLiMi代表了转移扩散的早期克隆状态，并持续处于静止的干细胞样状态，这可能导致MRD的出现。

为了捕捉空间转录异质性，他们应用非负矩阵分解（NMF）将基因表达分解为具有生物学意义的模块。使用Jaccard距离和层次聚类评估样本间的程序相似性，并将重叠的程序归类为重复出现的转录模块，将每个聚类中的共有标记基因定义为空间元程序（MP）。

在 CLiM 中，他们鉴定了 14 个高质量的 MP（排除了一个低质量 [LQ] MP），包括肿瘤相关 MP（TU_CEACAM5、TU_Cycling、TU_SLC2A1）、基质 MP（肌成纤维细胞癌相关成纤维细胞 [myCAF]、炎症性癌相关成纤维细胞 [iCAF]、平滑肌细胞 [SMC] 和内皮细胞 [Endo]）、免疫 MP（巨噬细胞：Mac_CD68 和 Mac_CLEC4G、中性粒细胞、T_B 和炎症细胞）、上皮 MP（EP_KRT7）和肝细胞 MP（图 3A-B）。在CLuM中，他们鉴定了9种MP，包括肿瘤细胞（TU_CEACAM5）、基质细胞（myCAF、iCAF和SMC）、免疫细胞（Mac_CD68、T细胞和炎症细胞）以及肺泡和毛细血管MP。在原发性CRC中，他们鉴定了11种MP（排除一种LQ MP），包括肿瘤细胞（TU_CEACAM5、TU_Cycling、TU_SLC2A1和TU_stem_LGR5）、基质细胞（myCAF、iCAF、SMC和Endo）、免疫细胞（Mac_CD68、中性粒细胞、T_B和炎症细胞）以及分泌性MP。此外，他们核对了每个斑点对应的配对H&E染色图像，并鉴定了与特定空间MP相关的不同细胞类型。为了鉴定所有器官中共有的空间转录调控因子和肿瘤部位特异性的MP，对所有空间MP进行了Jaccard相似性分析和层次聚类。各器官共有的空间MP包括Mac_CD68、T_B/T_cell、TU_CEACAM5、myCAF、SMC、iCAF、Endo、TU_Cycling、inflammatory/neutrophil和TU_SLC2A1，而其余的空间转录调控因子则具有部位特异性。总而言之，这些结果揭示了CRC转移灶中保守的空间转录调控核心，以及肿瘤和间质成分的器官特异性适应。

虽然Visium ST 可提供全面的转录组覆盖，但其局限性在于单个斑点内存在混合细胞群。为了克服这一局限性，他们将 PhenoCycler-Fusion 超高通量蛋白成像与 Visium HD ST 相结合，以单细胞蛋白和 RNA 分辨率验证他们的发现。IO60 抗体组捕获了关键的免疫、基质和肿瘤标志物。他们分析了 9 例 CLiM、3 例 CLuM 和 5 例原发性 CRC 样本中与 Visium ST 区域对应的相邻切片（图3C）。通过将 Visium ST 的 MP 热点与蛋白质定义的细胞类型进行关联，确认了多种不同成像模式下的代表性 MP。在CLiM中，这些细胞包括TU_CEACAM5（EPCAM）、T/B细胞（CD20、CD3e）、巨噬细胞（CD68）、中性粒细胞（MPO）、myCAF（IV型胶原）、SMC（SMA）、内皮细胞（CD31）和肝细胞（iNOS）（图3D-E）。在CLuM和原发性CRC中也观察到了类似的模式，表明转录组学和蛋白质组学具有很强的一致性。

为了进一步提高细胞分辨率，他们对来自五位患者的九个样本（八个 CLiM 样本和一个原发性 CRC 样本）进行了分析，并纳入了三个公开的原发性 CRC 样本。利用核分割和细胞水平重建，他们使用 Harmony按组织来源整合了数据集，并基于标记表达对细胞群进行了注释（图3F-I）。在所有样本中，他们从 CLiM 样本的 801392 个细胞中鉴定出 16 种细胞类型，从原发性 CRC 样本的 545885 个细胞中鉴定出 17 种细胞类型。使用 Jaccard 相似性比较差异表达基因 (DEG)，结果显示 MP与相应细胞类型之间存在一致的映射关系（图 3I），表明跨平台具有很强的一致性。

为了研究CRC侵袭结肠壁各层时的转录组变化，他们分析了黏膜/黏膜下层、固有肌层和浆膜下层的肿瘤和肿瘤微环境（TME）组成及通路活性（图4A）。结果显示，肿瘤相关MP如TU_CEACAM5表达增加，而TU_stem_LGR5和TU_Cycling表达降低。同时，TME相关MP，包括myCAF、Mac_CD68和Endo，随着肿瘤深度的增加而逐渐增多（图4A）。Mac_CD68表达与促肿瘤巨噬细胞状态相关的标志物（例如SPP1、TREM2），而myCAF富集细胞外基质（ECM）重塑基因（例如INHBA、THBS2、SPARC）。在原发性CRC中，肿瘤侵袭从黏膜和黏膜下层进展至固有肌层和浆膜下层，反映了肿瘤从肠壁浅层到深层的逐步侵袭过程。通路分析显示，侵袭至深层与上皮间质转化（EMT）、转化生长因子-β（TGF-β）信号通路、血管生成和分化通路的激活相关（图4B）。代谢分析显示，浅层以氧化磷酸化和三羧酸循环为主，而深层则以糖酵解和缺氧相关通路为主（图4B），表明肿瘤从富氧状态向缺氧适应状态转变。空间映射证实，EMT、侵袭、TGF-β信号通路、血管生成和糖酵解在深层富集，而氧化磷酸化则局限于浅层（图4C）。HIF-1α免疫组化结果进一步显示，肿瘤深层区域的核染色更强，证实了局部缺氧，并验证了蛋白水平的转录模式。综上所述，这些结果表明，CRC在组织层间的进展伴随着协调的转录和代谢重编程，最终向缺氧适应性和侵袭性表型转变。

为了研究TME中宏观转移灶和微观转移灶的空间差异，他们分析了CLiM和CLuM样本中MP的比例（图4D）。CLiMa病灶中肿瘤相关微粒（如TU_CEACAM5、TU_Cycling和TU_SLC2A1）以及TME相关微粒（如myCAF和Mac_CD68）的比例较高（图4D），而CLiMi病灶中淋巴细胞（T_B）和iCAF相对富集（图4D）。CLuMa中TU_CEACAM5和myCAF表达增加，而CLuMi中T细胞和Mac_CD68的比例较高。微转移灶中淋巴细胞的显著富集促使他们对T细胞状态和免疫抑制程序进行深入分析。对CLiMi肿瘤和间质区域的通路富集分析显示，与CLiMa相比，免疫调节通路（如CTLA-4信号通路、PD-1信号通路和IL-10信号通路）显著上调，同时适应性免疫反应、ROS解毒和苯丙氨酸代谢受到负调控（图4E）。这些结果在CLuMi与CLuMa的比较中也得到了证实。由于这些通路是已知的免疫抑制介质，研究结果提示微转TME中存在T细胞功能障碍和免疫逃逸。相反，与CLiMi和CLuMi相比，WNT/β-catenin和Hedgehog信号通路在CLiMa和CLuMa肿瘤细胞和间质区域中富集（图4E），这与它们在肿瘤生长和维持中的作用相符。

为了在校正T细胞丰度的情况下评估T细胞状态，他们将细胞毒性标志物（GZMB、IFNG、TNF）和耗竭标志物（PDCD1、CTLA4、LAG3、TIGIT）的表达水平标准化至CD3D表达水平。CLiMi和CLuMi中耗竭标志物水平升高，而CLiMa和CLuMa中细胞毒性标志物水平升高。针对CD3e、PD-1和GZMB的PhenoCycler-Fusion超高通量蛋白成像技术在蛋白水平上证实了这些趋势，结果显示微转移灶中PD-1+ T细胞增加，而GZMB+ T细胞减少（图4 F-H）。综上所述，这些数据表明微转移灶中耗竭T细胞的比例更高，支持RNA和蛋白水平上T细胞表型功能障碍的结论。

此外，与匹配的大转移灶相比，CLiMi 和 CLuMi 肿瘤及间质区域中免疫抑制分子（CD274、PDCD1LG2、FASLG、IL4I1、TGFB1等）显著上调。为了量化免疫抑制图谱，他们计算了免疫抑制评分，该评分在 CLiMi 和 CLuMi 中始终高于 CLiMa 和 CLuMa（图 4I）。空间映射进一步显示，这些升高的评分主要定位于 CLiMi（图 4 J）。使用不同距离（100–300 μm）和大小阈值进行的敏感性分析表明，微转移灶和大转移灶的分类仍然稳健，关键生物学特征在不同定义中得以保留。值得注意的是，虽然淋巴细胞富集，但微转移灶表现出 T 细胞耗竭和免疫抑制信号增强，表明存在协调的免疫逃逸程序。

为了研究 CLiM、CLuM 和原发性 CRC 中 MP 的空间组织和相互作用，他们分析了邻域组成和邻近性（图 5A）。邻域评分量化了分配给每个 MP 的周围区域所占的比例，而邻近性评分则测量了与其他 MP 定义区域的距离。这些指标用于构建跨组织的空间相互作用网络（图 5B）。基于每个 MP 的组成，他们进一步将 MP 分为肿瘤、肿瘤基质或正常组织，从而描绘了 TME 的调控结构（图 5B）。Mac_CD68 和 myCAF 是所有组织中肿瘤区域附近最常见的 TME 相关 MP（图 5B），这与其在肿瘤进展和免疫逃逸中的作用一致。聚焦于常见的 MP（TU_CEACAM5、myCAF、iCAF、SMC、Mac_CD68 和 T_B/Tcell），他们观察到不同肿瘤部位存在不同的空间模式（图5C-D）。与原发性CRC相比，CLiM和CLuM中TU_CEACAM5周围存在更高水平的基质MP（myCAF、iCAF、SMC），这与CAF介导的肿瘤扩散一致。相反，与CLuM相比，CLiM和原发性CRC中Mac_CD68（SPP1+，TREM2+）在肿瘤区域附近更为富集。CLuM中淋巴细胞更常出现在肿瘤区域附近，提示其具有独特的免疫微环境。接下来，他们使用cell2location技术对同一组织切片中的多个MP进行了可视化。在CLiM中，TU_CEACAM5与Mac_CD68和myCAF共定位（图5E）；在CLuM中，TU_CEACAM5与T细胞紧密相关（图5F）；而在原发性CRC中，TU_CEACAM5主要与Mac_CD68并列（图5G）。

为了在蛋白质水平上验证这些观察结果，他们对CLiM、CLuM和原发性CRC样本的Visium ST切片相邻切片进行了PhenoCycler-Fusion超高通量蛋白质成像。两种成像模式的手动比对显示，TU_CEACAM5在CLiM中与myCAF和巨噬细胞共定位，在CLuM中与T细胞共定位，在原发性CRC中与巨噬细胞共定位（图5H-J），这支持了从Visium ST数据推断出的空间邻近性。接下来，他们检测了myCAF、T细胞和巨噬细胞的功能标志物。在CLiM中，myCAF（Collagen+）表达SMA和波形蛋白，表明其具有收缩和细胞外基质重塑活性，而巨噬细胞（CD68 +）表达M2标志物CD163，但不表达M1标志物iNOS（图5K）。在 CLuM 中，T 细胞 (CD3e+) 表达耗竭标志物 PD-1 和 TOX（图5L），而在原发性 CRC 中，巨噬细胞 (CD68+) 表现出 M2 表型 (CD163+ iNOS−)（图5M）。

为了研究所有CLiM和CLuM样本中大转移灶和微转移灶之间MP空间分布的差异，他们将肿瘤区域扩展了三个点层，并进行了邻域和邻近性分析（图6A）。比较分析显示，CLiMa和CLiMi中T_B和myCAF与TU_CEACAM5的空间关系存在显著差异（图6B）。具体而言，CLiMi中T_B在TU_CEACAM5周围表现出更高的邻近性和邻域富集（图6B），这与近期在小鼠模型中的研究结果一致。相反，myCAF在CLiMa中显示出在TU_CEACAM5附近及其邻域的空间富集（图6B）。在肺转移灶中也观察到了类似的模式，这与之前的成分分析一致，并表明微转移瘤细胞与淋巴细胞的关联更为密切。为了进一步验证这些关系，他们对多个样本中大转移灶和微转移灶中 TU_CEACAM5、T_B 和 myCAF 的空间分布进行了可视化。始终观察到 TU_CEACAM5 与 T_B 在微转移灶中存在空间共定位，而 TU_CEACAM5 与 myCAF 在大转移灶中存在空间共定位（图6C-D）。

为了在蛋白质水平上验证这些观察结果，他们对配对的CLiMi和CLiMa样本中Visium ST切片相邻的玻片进行了PhenoCycler-Fusion超高通量蛋白质成像。两种成像模式的手动比对显示，TU_CEACAM5在CLiMa中与myCAF以及在CLiMi中与T细胞存在明显的共定位（图6E-F），这支持了从ST数据推断出的空间邻近性。接下来，他们评估了myCAF和T细胞的功能标志物。在CLiMa中，myCAFs（IV型胶原蛋白阳性）表达SMA和波形蛋白，表明其具有ECM重塑活性（图6G-H）。在CLiMi中，T细胞（CD3e阳性）表达耗竭标志物PD-1和TOX，表明其处于耗竭状态且活化受损（图6G-H）。利用配体-受体分析揭示了不同的区域特异性相互作用，在CLiMa中，TU_CEACAM5-myCAF相互作用主要通过LAMA3/A4/B3/C2-整合素、COL4A1-CD44和TNC - ITGB1信号通路富集（图6 I-K），这可能促进胶原蛋白收缩和细胞外基质重塑。相反，在CLiMi中，TU_CEACAM5与T细胞的相互作用主要由PGE2/PTGES2-PTGER4、NECTIN2/3-TIGIT、PVR-TIGIT和CD274-PDCD1信号通路介导（图6I-K），提示这些通路可能导致T细胞耗竭和抗肿瘤T细胞扩增的抑制。总之，这些数据突显了微转移瘤和巨转移瘤区域在空间组成和肿瘤微环境（TME）相互作用方面的显著差异，微转移瘤更常受到免疫细胞包围，而巨转移瘤则更密集地由基质myCAF包裹。

为了鉴定CLiMi特异性转录组特征，他们进行了差异表达基因（DEG）分析，比较了CLiMi、CLiMa及其周围正常肝实质样本（图7A），最终在Visium ST数据集中得到109个特征基因。然后，应用Wilcoxon检验筛选出在ST数据集中CLiMi肿瘤细胞中表达最高的基因，最终得到包含六个基因的特征基因（BCL7B、COX17、RNF40、YME1L1、WEE1和AEN）。跨样本的特征评分显示，在ST数据集中，CLiMi中的这些基因表达显著高于CLiMa和正常区域（图7B）。空间映射进一步证实了ST 数据集中的 CLiMi 病灶中六基因特征的富集（图 7 C-D），支持其对微转移区域的特异性。

为了确定该特征如何映射到大转移性肿瘤中的恶性细胞亚群，他们分析了来自四个CLiM样本的内部scRNA-seq数据，每个样本均包含成对的CLiMa和CLiMi区域。对恶性细胞进行降维和聚类分析后，发现了一个独特的肿瘤细胞亚群，该亚群具有RNF40、AEN、WEE1、BCL7B、YME1L1和COX17的协同高表达，以及较高的六基因综合评分（图7E-G）。将该亚群定义为MicroMetSigˆhi肿瘤细胞聚类。为了验证这一发现，他们使用 scANVI 将两个独立的公共 CRC scRNA-seq队列与内部数据整合,揭示了一个保守的恶性亚群，该亚群具有六个基因协同高表达的特征，包含了 MDACC 队列中的大多数 MicroMetSigˆhi 肿瘤细胞，该亚群在公共数据集中注释为 MicroMetSigˆhi 肿瘤细胞。

通路分析显示，CLiMa中的MicroMetSigˆhi肿瘤细胞富集干性和静止程序，干性标志物（SOX2和SOX9）和免疫抑制通路（包括IL-4信号通路和适应性免疫反应的负调控）的表达均增强（图7H）。这些特征与Visium ST和多重免疫荧光结果一致。RNA速度分析进一步表明，MicroMetSigˆhi肿瘤细胞处于肿瘤细胞演化轨迹的早期阶段，这与LCM-WGS推断的进化层级一致。综上所述，这些发现定义了CLiMa中一种独特的恶性细胞状态，其特征为干细胞样、静止和免疫抑制。这些结果共同提示，MicroMetSigˆhi细胞群可能促进微转移播散和治疗耐药。

为了评估CLiMi特征的临床意义，他们首先评估了六基因评分对MDACC内部队列接受结直肠癌转移切除术患者的微小残留病灶无进展生存期（MRD-FS）和无病生存期（DFS）的预后价值。ctDNA状态采用肿瘤信息检测法进行测定，该检测在术前和术后作为MRD监测项目的一部分进行。Kaplan-Meier分析显示，CLiMi六基因特征高表达与较差的DFS和MRD-FS显著相关（图7I）。多变量Cox回归进一步证实该基因特征是DFS和MRD-FS的独立预测因子。与此一致的是，发生复发的患者的六基因特征评分显著高于未复发的患者（图7 J）。

为了进一步评估CLiMi特异性基因特征在治疗耐药中的生物学意义，他们比较了四例患者首次切除（基线）CLiM和化疗后复发CLiM的ST衍生六基因特征评分（图7K），结果显示复发CLiM的六基因特征评分显著升高（图7K-L）。为了解析这一变化的细胞学基础，他们使用RCTD对Visium ST斑点进行了单细胞信息反卷积分析。该分析表明，与基线相比，复发CLiM中MicroMetSigˆhi肿瘤细胞的比例增加（图7M），提示六基因特征富集与化疗耐药之间存在关联。为了验证这些发现，他们分析了一个公开的scRNA-seq数据集（GEO：GSE285991），该数据集包含来自10名患者的33357个肿瘤细胞，并标注了化疗前、部分缓解（PR）和化疗后疾病进展（PD）状态；此外，他们还分析了一个包含化疗/放疗前后样本的RNA-seq队列（GEO： GSE131418）（图7N-O）。与本研究的数据一致，该特征在化疗后和耐药样本（包括PD病例）中均升高（图7N-O），支持其与耐药疾病状态的可重复关联。

为了进一步评估六基因特征在原发性结直肠癌中的预后价值，他们分析了一个独立的公共RNA-seq队列（GEO：GSE21510），该队列包含146例原发性结直肠癌相关样本，并标注了转移状态。转移性肿瘤的六基因特征评分显著高于无转移性肿瘤（图7P），表明该特征与转移性肿瘤生物学相关。在另外两个外部验证队列TCGA和GEO数据集GSE17538中，CLiMi六基因特征的高表达与较短的无病生存期（DFS）相关（图7Q），并显示出与较差的总生存期（OS）相关的趋势。综上所述，这些结果支持CLiMi六基因特征作为一种可靠且可重复的生物标志物，用于预测不同CRC队列中的复发和不良预后。

本研究对来自19例患者的49个肿瘤样本进行了空间多模态分析，系统发育重建显示，CLiMi起源于早期克隆分化，并具有干细胞样静止状态，与转移休眠相符。在空间上，发现了不同的基质屏障：大转移灶由肌成纤维细胞包裹，而微转移灶则由免疫抑制微环境包围，这些微环境的特征是T细胞耗竭和独特的配体-受体信号网络。值得注意的是，他们在多个独立队列中鉴定出一个与MRD状态、无病生存期和化疗耐药性相关的CLiMi特异性六基因特征。这些发现阐明了CRC转移的空间演化图谱，并提供了基于组织、经空间验证的生物标志物，可用于监测和治疗靶向。