文章解读|Cancer Cell（44.5）：剖析乳腺癌脑转移的细胞结构揭示了预后不同的免疫图谱

乳腺癌（BC）是女性最常见的癌症，也是一种高度异质性的疾病。系统治疗方案需根据主要亚型进行精准调整，包括管腔型乳腺癌、人表皮生长因子受体2（HER2）阳性乳腺癌和三阴性乳腺癌（TNBC）。虽然乳腺癌治疗取得了显著进展，例如靶向复发性改变驱动基因的药物研发，以及将基于多组学的精准肿瘤学整合到临床工作流程中，但转移性乳腺癌目前仍是无法治愈的。高达32%的转移性乳腺癌患者会发生脑转移（BCBM）。脑转移的治疗策略包括手术、放疗和系统治疗。然而，脑转移患者的中位生存期仅为16个月，与其他部位转移的患者相比，预后最差，这凸显了开发对脑转移也有效的改良疗法的迫切需求，目前对BCBM免疫微环境异质性和免疫治疗敏感性的全面了解仍然不足。

为了探索BCBM患者的免疫微环境，研究团队对156例经神经外科手术切除并冷冻保存的组织样本和有活性的单细胞悬液进行了多模态分析，随后结合临床数据进行了整合分析（图1A）。所有研究的脑转移组织均经神经病理学确诊为乳腺癌组织学类型，构建了一个同质的BCBM队列，且涵盖了所有主要的乳腺癌亚型（图1B）。值得注意的是，15%的患者在病程中发生了BCBM亚型的转变，最常见的是从管腔型原发性乳腺癌转变为三阴性乳腺癌（图1C）。BCBM切除时，患者平均年龄为55岁，且大多数患者接受过全身抗肿瘤治疗，例如化疗和靶向治疗（图1D-E）。接下来，他们在单因素和多因素生存模型中评估了临床变量。在Kaplan-Meier分析的相关变量中，BCBM亚型、患者Karnofsky功能状态评分（KPI）、BCBM数量和BCBM位置在多变量Cox比例风险模型中均具有显著性（图1F）。重要的是，亚型、KPI和BCBM数量均为已知的生存预测因子，并已纳入已建立的BCBM分级预后评估（GPA）评分，这表明队列具有代表性，且样本量足以进行多变量生存分析。此外，观察到的小脑BCBM预后极差，这是GPA评分中未包含的新发现。这可能表明脑转移部位之间存在不同的不利微环境，与利用GABA能信号通路的乳腺癌细胞的研究结果一致，而GABA能信号通路在小脑中尤为突出。

随后，他们采用组织细胞计数法（即多重免疫荧光成像和半自动图像分析，包括细胞分割和类似流式细胞的设门）测定了137例BCBM样本中作为主要免疫效应细胞的T细胞数量（图1G）。值得注意的是，他们评估了整个切片上的细胞密度，与例如较小的组织芯片相比，这种方法能更可靠地反映肿瘤中免疫细胞的数量。虽然CD8+和CD4+ T细胞在肿瘤周围区域均有空间富集（图1H），但通过细胞角蛋白检测鉴定的肿瘤内T细胞密度与肿瘤周围T细胞密度显著相关，表明T细胞一旦到达脑转移瘤微环境，就会按比例浸润肿瘤岛（图1I-J）。这可能是由于血脑屏障的穿过是T细胞浸润至BCBM的关键步骤，而脑实质微环境的特异性并不像在原发性乳腺癌中观察到的那样，有利于将T细胞排除在肿瘤区域之外。总体而言，BCBM中T细胞密度在不同患者间存在高度异质性，范围从6个细胞/mm到874个细胞/mm（图1K）。CD4+和CD8+ T细胞浸润率与临床参数（如乳腺癌亚型、肿瘤位置、患者年龄、KPI评分、颅内和颅外转移灶数量）以及患者的术前治疗（包括术前糖皮质激素治疗）均无显著相关性（图1K-M）。接下来，他们进行了生存分析，以研究所检测到的T细胞数量的临床意义。与细胞毒性CD8+ T细胞具有肿瘤控制功能的假设相一致，BCBM中CD8+ T细胞密度较高与患者生存期延长相关，这一结果在单因素和多因素模型中均得到证实，是一个独立于临床预后变量的预后标志物（图1N-O）。这些数据证实了先前关于CD8+ T细胞在较小规模的BCBM队列或混合实体BM队列中与生存期呈正相关的报道。

除T细胞外，先前已有研究描述了骨髓中存在多种其他免疫细胞类型。为了评估这些细胞在不同患者中的浸润情况，他们同样利用组织细胞计数法，采用经典标记组合对137例BCBM连续切片中的主要免疫细胞类型进行了定量分析（图2A）。肿瘤相关小胶质细胞（MG）和巨噬细胞（TAM）是最丰富的免疫细胞类型，其次是T细胞。同样，不同患者的免疫细胞密度差异很大（图2A）。与T细胞不同，粒细胞、B细胞和树突状细胞（DC）的数量在TNBC亚型的BCBM中显著升高，但未观察到与临床参数的其他显著相关性。分别对每种免疫细胞类型进行研究，发现表达 HLA-DR 的高密度 TAM（一种指示免疫刺激状态的标志物）以及 CD8+ T 细胞具有积极的预后意义。

为了进一步阐明浸润BCBM的不同免疫细胞之间可能存在的相互联系，他们对队列中每个样本的免疫细胞丰度进行了无偏聚类分析。这种细胞类型整合方法揭示了BCBM中的五种免疫生态型（图2C-K）。近一半（47%）的BCBM样本归类为免疫沙漠（生态型1），即免疫细胞数量最少，或表现出淋巴细胞计数低但中位粒细胞密度最高（生态型2）。相比之下，先前定义为含有高CD8+ T细胞的BCBM样本则分为生态型3-5。其中，主要由T细胞和肿瘤相关巨噬细胞（TAM）构成的生态型3，与一小部分由包括粒细胞在内的更广泛细胞类型炎症的样本（生态型4）以及B细胞数量显著高的生态型5明显不同。

通过对临床数据的关联性分析，发现生态型与患者年龄和既往治疗无关。生态型2、4和5在BCBM中占有相当大的比例，这与TNBC脑转移中粒细胞显著增多的总体发现相吻合（图2L）。免疫沙漠生态型1在小脑中最少见（图2M），这可能表明免疫细胞进入大脑不同部位的能力存在差异。尽管与临床协变量存在这些关联，但多因素生存分析显示，生态型3和5均能独立预测更长的总生存期，提示这两种生态型包含过量的肿瘤控制免疫细胞表型（图2N）。

由于组织细胞计数依赖于预先定义的标记物，他们接下来尝试对BCBM中存在的所有细胞进行深入且无偏倚的分析。因此，他们对28例BCBM样本进行了单细胞核转录组分析（snRNA-seq）（图3A）。他们重点关注TNBC亚型，因为TNBC与BCBM患者预后不良相关（图1F），同时在临床上使用免疫检查点阻断疗法（ICB）时具有免疫原性。他们选择的样本在CD8+ T细胞浸润率和生态型多样性方面能够代表整个队列（图3B）。为了获得更全面的信息，他们对单个细胞核而非单个细胞进行测序，避免了因剧烈组织解离而导致的潜在细胞损失，并且优化了细胞核分离方案（图3A）。

他们共分析了56268个 BCBM 细胞，每个细胞平均有8228个独特的分子标识符 (UMI)，对应3513个基因（图 3C）。他们利用差异表达基因( DEG)中的经典标记，并参考已发表的数据集，对 12 种主要细胞类型进行了注释（图3D）。其中，71%的细胞鉴定为肿瘤细胞，包含一个增殖亚群（图3E）。他们应用基于基因特征的预测器 SCEVAN和使用inferCNV推断主要拷贝数变异 (CNV)，进一步证实了恶性细胞和非恶性细胞之间的区别。非肿瘤细胞包括脑内驻留细胞[神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞(ODG)]、血管相关细胞[（内皮细胞(EC)、周细胞和基质细胞）]和免疫细胞（T 细胞、NK 细胞、髓系细胞、B 细胞和浆细胞）（图3C-D），主要细胞类型的比例与匹配的组织细胞计数数据高度相关。

髓系细胞在BCBM中非肿瘤细胞中所占比例最大（图3E），通过亚群分析对其进行表征，并根据其显著标记基因进行注释（图3F-G）。可区分出一个单核细胞亚群、一个树突状细胞亚群和八个肿瘤相关巨噬细胞（TAM）亚群，其中包括一个增殖型亚群和两个类似髓系巨噬细胞（MG）的表型。正如预期的那样，TAM状态并不符合以往基于体外实验的M1/M2二分法。相反，这些亚群包含了多种脑肿瘤或乳腺癌相关TAM、巨噬细胞和MG表型的特征。将结果与组织细胞计量数据（检测到预后良好的HLA-DR+ TAM）相结合，发现四个TAM亚群表现出相对较高的HLA-DR、HLA-DP和HLA-DQ表达以及抗原呈递相关特征（图3G）：（1）TAM STAT1+，类似于在胶质母细胞瘤（GBM）中发现的具有干扰素特征的TAM；（2）TAM HSPE+，表现出抗原呈递细胞（APC）和疾病相关MG的特征，但同时也表达与免疫抑制功能相关的基因，例如ICOSLG和IL10。最后，他们鉴定了两个MG TAM亚群：(3) TAM MG HAMP +，其表达C4B等标记基因和其他编码补体因子的基因；(4) TAM MG CCL3+，其高表达CCL3、CCL4、SPP1和TNF等细胞因子基因，并伴有较高的疾病相关MG特征。值得注意的是，在BCBM队列的RNA-seq数据中，这两个TAM MG亚群的高特征评分也通过组织细胞计量学分析证实与患者生存期延长独立相关，这与之前关于HLA-DR+ TAM的研究结果一致。相比之下，另一个显著的亚聚类由 MCR1+ TAM 构成，这些亚聚类上调了通常与免疫抑制表型相关的基因，例如MRC1、CD209和CD163，以及在GBM和BC中发现的TAM 特征。TAM MARCO +和 TAM CXCL13+与免疫抑制状态相关的类似表达标记基因，如编码 PD-L1 的MARCO和CD274，但也类似于 GBM 中吞噬性 TAM 的特征。

利用snRNA-seq技术对T/NK细胞进行分析，并进行了亚群分析（图3H-L）。在2142个分析的细胞中，可以区分出4个CD4+ T细胞亚群、3个CD8+ T细胞亚群和1个NK细胞亚群，并根据其标记基因进行注释（图3I）。NK细胞仅占细胞总数的一小部分，进一步研究源自该亚群的BCBM NK细胞特异性基因表达特征，并未发现其与患者预后差异相关（图S10）。在CD4+ T细胞群中，CD4+ TCM（中央记忆T细胞）亚群的特征是表达淋巴结归巢受体CCR7和SELL（编码CD62L）以及TCF7。它们与通过趋化因子受体基因CCR5和CCR6鉴定的 CCR6+CD4+T 细胞以及表达滤泡辅助细胞和组织驻留T细胞基因的一小部分 CD4+T 细胞亚群相分离（图 3I）。值得注意的是，20% 的 CD4+T 细胞表现出调节性 T 细胞表型（CD4+T REG）（图3H-I）。CD8+ T 细胞包含两种主要表型：（1）表达高水平免疫检查点标志物（如PDCD1（编码 PD-1）、编码效应分子的基因（包括GZMB、GZMH和PRF1）的细胞，提示其具有效应功能，以及 NK 样特征（如KLRC1）。这些细胞的表型与组织驻留记忆T细胞相似，包括ITGAE（编码CD103）等基因的表达，因此称为CD8+组织驻留样记忆T细胞（CD8+ TRM样细胞）（图3I-L）。BCBM中的CD8+T RM样细胞与先前在原发性乳腺癌中鉴定的CD8+ TRM细胞亚群具有相似的表型特征。（2）相反，其余的CD8+T细胞以免疫检查点标志基因表达较低和GZMK（CD8+ T GZMK+细胞）（图3I-K）。值得注意的是，CD8+ TRM样细胞包含一个增殖亚聚类，并表现出与肿瘤反应性T细胞相关的总体表型（图3K），表明它们在肿瘤控制中发挥着积极作用。

为了验证并进一步探索 CD8+ T 细胞表型，他们采用流式细胞技术对 8 例新鲜切除的BCBM中的肿瘤浸润 T 细胞进行表征，并与术前采集的匹配血液样本中的 T 细胞进行比较（图4A）。总体而言，肿瘤浸润 CD8+ T 细胞与血液 T 细胞显著不同，其激活标志物和免疫检查点分子的表达水平更高（图 4B）。BCBM中 CD8+ T 细胞相对富集，其中 CD8+记忆T细胞的比例更高，特别是 CD103 阳性的 CD8+ TRM样细胞，这些细胞表现出抗原经历T细胞的表型（CD45RO+CD45RA − CCR7 −）（图4C-D）。对 BCBM CD8+ T 细胞的深入分析证实，与 CD8+效应 T 细胞、效应记忆T 细胞和中央记忆 T 细胞亚群相比，CD8+TRM样细胞表达最高的 CD38、CD69、PD-1、TIM-3、TIGIT和 LAG-3（图4E-F），并且表现出较高的 GZMB 水平和较高的增殖细胞比例的趋势，以Ki-67表示（图 4 G）。

分析数据表明，CD8+TRM样细胞在肿瘤控制中发挥着至关重要的作用。为了获得其杀伤肿瘤细胞能力的实验证据，他们开发了一种完全自体肿瘤类器官T细胞杀伤实验。将分选并激活的BCBM来源的CD8+T RM样细胞或CD8+非TRM样记忆T细胞与自体肿瘤类器官共培养，这些肿瘤类器官大小标准化，且与来源的BCBM相似（图4H）。对肿瘤细胞活力的长期评估显示，所有共培养组中肿瘤细胞凋亡均显著增加，表明两种CD8+ T细胞亚群均具有肿瘤控制功能（图4I-K）。相比之下，CD8+ TRM样细胞的杀伤能力高于CD8+非TRM样记忆T细胞（图4I-K）。

在对其表型和功能进行表征后，他们试图研究CD8+ TRM样细胞亚群的临床意义。因此，他们重新分析了137例BCBM的完整组织样本，并通过组织流式细胞定量分析了CD8+ T RM样细胞（鉴定为CD8+CD103+ T细胞）（图4L-O）。虽然肿瘤区域和肿瘤周围区域中CD8+T细胞的比例没有显著差异，但在肿瘤岛内，CD8+ TRM样细胞占CD8+T细胞的比例显著升高（图4 M）。CD8+TRM样细胞在肿瘤内的空间富集与其细胞毒性功能需要与肿瘤细胞紧密接触的假设相符。最重要的是，在CD8+ T细胞高度浸润的 BCBM 中，CD8+ TRM样细胞比例较高在单变量和多变量模型中预后良好（图4N-O）。因此，即使在 CD8+ T细胞高度浸润的病例组中，CD8+ TRM样细胞亚群的定量也可以区分预后较好和较差的BCBM患者。

为了深入解析已鉴定的TRM免疫图谱在BCBM组织中的形成机制以及可能参与的其他细胞类型，他们利用单细胞分辨分子图谱技术对8例BCBM样本进行了空间转录组学分析（图5A）。由于该方法的转录本选择基于snRNA-seq数据集，因此他们可以在组织背景下注释所有主要细胞类型以及髓系和T细胞亚群（图5B）。为了验证数据的有效性，配对样本在snRNA-seq和空间转录组学数据集中表现出相似的细胞类型频率。

连续共聚焦成像对同一张切片进行了伪HE染色和细胞角蛋白染色，从而能够精确地划分和定义肿瘤及其周围区域（图5C）。聚焦于T细胞亚群，发现CD4+TCM和CD4+TREG细胞在肿瘤周围区域的频率较高。与组织细胞计数数据及其与肿瘤细胞的直接相互作用相一致，CD8+TRM样细胞（而非GZMK+ CD8+ T细胞）在肿瘤区域内空间富集（图5D）。基于snRNA-seq数据集中的配体-受体对表达，CD8+ TRM样细胞和GZMK+CD8+ T细胞进一步显示出与肿瘤细胞独特的推断相互作用（图5E）。CD8+ TRM样细胞与肿瘤细胞的相互作用以相互的TGF-β信号通路为特征，该通路此前已证实与T RM的促进作用相关。其他提出的特异性相互作用包括肿瘤HLA-E与CD8+ TRM样CD94/NKG2C的结合，这是其NK样特征之一，可能共同介导其活化，但另一方面，也预测了通过PVR/NECTIN2-TIGIT轴的抑制性信号传导。相反，预测肿瘤细胞通过表达FN1、COL6A2和COL4A2（作为T细胞CD44的配体）或其他与T细胞迁移相关的轴（例如EFNA5/EFNA1-EPHA4）与GZMK+ CD8 + T细胞相互作用，这可能有助于其在组织内的定位。

为了更全面地追踪BCBM中不同CD8+ T细胞亚群的潜在细胞调节因子和相互作用伙伴，他们对其直接邻近细胞进行了定量分析（图5F）。CD8+ TRM样细胞更常见于肿瘤细胞附近，而GZMK+CD8+T细胞则更常见于基质细胞、B细胞、浆细胞和其他T细胞附近（图5G）。进一步细分T细胞亚群，GZMK+CD8+T细胞更常与CD4+ TCM细胞和CD4+TREG细胞相邻（图5H）。在髓系细胞群中，MRC1+ TAM显著多见于GZMK+CD8+ T细胞附近，且CD8+ TRM样细胞附近增殖性TAMs的趋势更强（图5I）。他们再次搜索了两种CD8+T细胞亚群及其不同邻近细胞类型之间独特的预测配体-受体配对（图5J）。与预测的肿瘤细胞相互作用类似，CD8+ TRM样细胞的主要相互作用包括邻近细胞上的HLA-E与CD8+ TRM样细胞上的NK相关受体（如 KLRC1、KLRC2和CD94）之间的相互作用。对于 GZMK+ CD8+ T 细胞，一个显著的独特预测相互作用是GZMK+ CD8+ T细胞表达的IL-16靶向TREG和 MRC1+ TAM上的CD4，这两种细胞类型均具有免疫抑制特性，这可能有助于它们的募集和调控。总之，BCBM中的CD8+TRM样细胞与GZMK+ CD8+T细胞定位于不同的组织微环境中，涉及不同的邻近细胞和推测的相互作用，这可能导致它们功能上的差异。

BCBM CD8+ T细胞，尤其是CD8+ TRM样细胞亚群，高表达PD-1和TIGIT，以及相互作用组分析表明TIGIT轴具有相关性，提示BCBM可能对相应的免疫检查点阻断疗法（ICB）敏感。为了验证这一结论，他们使用BCBM患者的肿瘤细胞培养物，并加入自体肿瘤浸润淋巴细胞（TIL），评估了在有无PD-1/TIGIT阻断的情况下，肿瘤细胞杀伤和T细胞活性（图5K）。CD8+ TRM样细胞在共培养中表现出比其他CD8+ TIL更强的活化，这凸显了它们的作用，表现为4-1BB、CD69以及效应分子GZMB和TNFα表达的增加（图5L-O）。在12例患者中的9例中，他们观察到体外TIL介导的肿瘤细胞杀伤作用显著，这可能反映了患者间免疫原性的异质性（图5P-Q）。值得注意的是，同时靶向PD-1和TIGIT的双重ICB治疗可显著降低肿瘤细胞活力，而单独使用任一单药治疗则无此效果（图5R）。同时，双重ICB治疗后，CD8+ T细胞的4-1BB和CD69表达进一步增加。综上所述，这些数据表明双重ICB治疗能够重新激活BCBM中的CD8+ T细胞反应。

本队列研究的另一个有趣发现是，在5型生态型中观察到部分BCBM存在T细胞和B细胞的共浸润（图2B）。在检查针对这些细胞类型染色的全组织扫描图像时，在所有BCBM病例中，11%的病例以及5型生态型病例中，59%的病例中，B细胞和T细胞在空间上聚集形成大型血管周围簇，类似于三级淋巴结构（TLS）（图6A-C）。这些结构类似于淋巴滤泡，已在多种颅外肿瘤中检测到。BCBM中的所有TLS均包含成熟的DC-LAMP+DC，这是一种常用的TLS定义细胞类型，在整个队列的BCBM中相对罕见（图6A-B）。在两例BCBM中，TLS内可区分出空间分布的B细胞和T细胞区域，而大多数TLS则呈现为结构较为松散的聚集体（图6A-B）。最引人注目的是，TLS的存在能够预测BCBM患者的总生存期，其风险比甚至低于5型生态型整体，这表明TLS可能标记或定位具有功能相关性的抗肿瘤免疫过程（图6E-F）。有趣的是，CD8+ TRM样细胞高表达的BCBM与出现TLS的BCBM之间的重叠部分极少，提示抗肿瘤免疫可能存在不同的机制或不同的时间快照（图6D）。值得注意的是，TLS最常见于BCBM，其次是HER2富集型BCBM，在管腔型BCBM中则很少见，且未发现任何其他临床关联，包括患者治疗前的情况。

通过空间转录组学分析，他们发现四个BCBM样本中含有TLS结构，可以对其进行深入表征（图6G-K）。他们基于注释的细胞进行了空间域分析，从而在这些样本中鉴定出7个细胞群落，其中一个标记了含有TLS的区域（图6G）。与TLS的定义一致，TLS样空间域显著富集了T/NK细胞、B细胞、浆细胞、髓系细胞和基质细胞（图6G-H）。他们还观察到淋巴结构中常见的T细胞亚群数量增加，包括CD4+TCM细胞和CD4+ T FH/TRM样细胞，即具有滤泡辅助细胞表型的细胞（图6I）。值得注意的是，通过组织细胞计数法对n = 137 例 BCBM患者队列中CD4+ T FH/TRM样细胞进行定量分析，证实了这些细胞在具有 TLS 的组织中显著富集，且这些细胞的高数量与患者良好的预后独立相关。在髓系细胞中，TLS样区域主要由新定义的 CXCL13+ TAM 亚群构成，该亚群强烈表达相应的 B 细胞趋化因子（图 6J）。此外，他们还研究了空间转录组数据集中不同空间区域的差异基因表达。结果揭示了BCBM TLS 特异性特征，该特征包含一些独特的上调基因，其中许多与 TLS 特异性细胞类型相关，例如CXCL13、CD40L和CCR7（图 6K）。

组织细胞计数和空间转录组学是耗时耗力的方法，目前尚无法应用于大型临床队列。为了推动研究结果的转化应用，他们针对预后良好的BCBM免疫图谱构建了基因表达特征。作为基于空间域分析的TLS特征的补充，他们利用匹配的组织细胞计数数据作为真值，基于BCBM RNA-seq数据，开发了免疫图谱的机器学习预测模型（图7A）。

两种特征均在独立的BCBM和原发性BC队列中测试了其预后价值。首先，他们计算了来自CATCH队列（一项针对转移性BC的精准肿瘤学试验）的35例BCBM患者的TRM和TLS特征评分（表S1）。虽然队列规模有限，但仍观察到与发现队列相同的临床预后因素趋势，包括BCBM亚型、患者年龄、KPI评分以及并发BCBM的数量。在单因素和多因素生存模型中，高TRM特征评分与更长的总生存期显著相关，证实了TLS免疫图谱替代标志物的独立预后价值（图7B-C）。 TRM 特征评分与肿瘤突变负荷 (TMB) 或微卫星不稳定性 (MSI) 均无相关性，而62 个肿瘤特征与ICB治疗反应相关，这表明该特征可能具有额外的临床应用价值（图 7D）。TLS 特征评分在 CATCH BCBM 队列中显示出与生存期独立相关的强烈趋势（图 7E-F），同样与 TMB 或 MSI 无相关性（图7G）。通过对 CATCH BCBM 队列中患者匹配的组织切片进行多重染色，验证了 TRM 和 TLS 特征评分预测各自免疫图谱的能力及其预后价值，这与发现队列类似。他们还有机会研究了四例患者匹配的肝转移灶中的TRM和TLS评分，以评估空间和时间上的免疫图谱异质性，但在这个小样本队列中未观察到任何明显的模式。总体而言，TRM特征的预后能力以及TLS特征的预后能力在CATCH BCBM队列中得到了验证，为后续的临床研究铺平了道路，例如评估这些特征对颅内ICB疗效的预测价值。

接下来，他们感兴趣的是，他们的研究结果是否可以推广到原发性乳腺癌。因此，他们计算了原发性乳腺癌TCGA数据集中的TRM和TLS评分。此外，基于基因表达，使用PAM50分类法确定了乳腺癌亚型，其中基底样亚型占TNBC的80%，因此是最接近的亚型。值得注意的是，TRM特征评分在原发性乳腺癌中也具有类似的预后价值（图7H），从而将在BCBM中的研究结果推广到了原发性肿瘤。预测的免疫图谱在基底样亚型肿瘤中的发生率最高，而在管腔型乳腺癌中则非常低（图7I），这与原发性TNBC总体上较高的免疫原性相一致，这与BCBM中免疫图谱更为均衡的亚型分布形成对比，这可能表明原发肿瘤和BCBM之间的免疫原性存在差异，尤其是在管腔亚型中。TRM评分的预后价值在多变量模型中得以保留，证明了其在原发性乳腺癌中的独立性（图7J）。非常相似，TLS特征评分与原发性乳腺癌患者的更长生存期相关（图7K），在基底样亚型中比在管腔亚型中更常见（图7L），并且在多变量模型中具有稳定的预后价值（图7M）。与肝转移一致，TRM和TLS评分在45例原发性乳腺癌及其匹配的BCBM样本之间均未显示出相关性，这凸显了评估预后领先的BCBM组织特征的临床必要性。然而，对另外4088 例原发性乳腺癌患者（包括有转移和无转移的患者）的评估显示，尤其是在基底细胞癌和 HER2 原发性乳腺癌中，未发展为转移性疾病的患者的 TRM和 TLS 评分更高（图 7N-O），这表明这些免疫微环境在原发性乳腺癌中具有保护作用。

最后，他们研究了TRM和TLS特征是否不仅具有预后价值，而且能够预测ICB的疗效。在多个独立的ICB治疗患者队列中，包括黑色素瘤、胃癌、肺癌和两个乳腺癌队列（GSE173839、GSE194040），TRM特征评分在应答者中显著高于无应答者（图7P）。TLS特征评分在黑色素瘤、肺癌和其中一个乳腺癌队列中也显示出与ICB疗效类似的关联（图7Q）。重要的是，受试者工作特征曲线（ROC曲线）分析显示，接受ICB额外治疗的乳腺癌患者的曲线下面积（AUC）值高于仅接受紫杉醇治疗的乳腺癌患者，这表明TRM和TLS特征可能作为ICB特异性预测生物标志物用于乳腺癌治疗。

本研究利用组织细胞计数、RNA-seq和snRNA-seq、流式细胞和空间转录组学等多模态技术，结合患者来源模型的功能研究，对156例临床注释完善的BCBM队列的免疫微环境进行了多模态分析。整合分析揭示了两种可预测患者生存期延长且无法从配对的原发肿瘤中推断出的免疫图谱：1）BCBM中CD8+TRM比例较高，这些细胞是肿瘤免疫控制的主要参与者；2）BCBM中含有三级淋巴结构。这些图谱的替代特征在独立的BCBM和原发性乳腺癌队列中均具有预后价值，与较少的转移相关，并能预测免疫治疗反应。本研究为 BCBM 中的抗肿瘤免疫提供了重要的见解，并发现了具有转化意义的新型生物标志物。